蛋白酶K酶活力及杂质检测方法标准征求意见稿-中国标准化研究院

下测其吸光值，以0号管作为空白调仪器零点。以横坐标为L-酪氨酸标准工作液浓度C（μg/mL），纵坐标则为吸光值A680绘制标准曲线。如下图1所示。

图1 L-酪氨酸标准曲线

6.3.2 蛋白酶K酶活力测定的底物的确定 6.3.2.1 底物溶液的配制

由于不同的蛋白质底物的溶解性不同，故不同的底物溶液配制方法有差异。除测定碱性蛋白酶的底物用0.1 mol/L的硼酸缓冲液（pH 10.0）配制以外，测定其他蛋白酶的底物均用磷酸缓冲液（PBS）配制。

（1）1%酪蛋白溶液，1%明胶溶液

准确称取酪蛋白/明胶1.000 g，精确到0.001 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠5.0 mL湿润后，再加入0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH为受试酶的最适pH）80 mL，于磁力搅拌器上边加热边搅拌30 min，直至完全溶解。冷却后，用0.1 mol/L盐酸或0.5 mol/L氢氧化钠，单向调整pH至磷酸缓冲液pH值，并转移到100 mL容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度。4 ℃冷藏备用。

（2）1%角蛋白溶液

9

用0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH为受试酶的最适pH）将5%浓度的角蛋白试剂稀释至1%，4 ℃冷藏备用。

（3）1%血红蛋白溶液，1%BSA溶液，1%组蛋白溶液

分别准确称取血红蛋白，BSA，组蛋白 1.000 g，用0.1 mol/L的PBS（pH为受试酶的最适pH）溶解并定容至100 mL，4 ℃冷藏备用。 6.3.2.2 蛋白酶溶液的配制

分别准确称取待测蛋白酶0.0010 g，以0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH为受试酶的最适pH，见表2）配制成1.0 mg/mL的样品酶液，再稀释至适宜的浓度作为待测酶液。6种蛋白酶的最适反应温度及pH见表2。

表2 受试蛋白酶的最适反应温度与pH

酶种类 蛋白酶K 木瓜蛋白

酶

菠萝蛋白

酶

α-胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 碱性蛋白酶

反应温度/℃ 37 40 55 37 37 45

pH 7.5 6.0 7.2 7.2 8.0 10.0

注：中性蛋白酶以磷酸缓冲液配制并稀释至适宜浓度，碱性蛋白酶以硼酸缓冲液配制并稀释。

6.3.2.3 蛋白酶活力检测方法

参考GB/T 28715-2012分光光度法测定6种蛋白酶酶活力。 6.3.2.4 底物种类对蛋白酶K酶活力测定的影响

选择适宜浓度的蛋白酶K溶液，分别以酪蛋白，角蛋白，血红蛋白，BSA，组蛋白为底物，于37 ℃下反应10 min，测定酶活力；以相应底物对其他蛋白酶酶活力测定的影响为对照，研究底物种类对蛋白酶K酶活力测定的影响。各种蛋白酶反应的最适温度和pH参照表2。

6.3.3 蛋白酶K酶活力测定的最适pH值的确定

10

（1）配制0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），并以各pH值缓冲液分别配制牛血红蛋白溶液(1%)与蛋白酶K溶液(0.01mg/mL)，按照6.3.2.3方法在37 ℃水浴中反应10 min后，离心后取上清液，显色，检测酶活力。 （2）配制0.01 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 7.1、7.5、8.0、8.5、8.9），并以各pH值缓冲液分别配制牛血红蛋白溶液(1%)与蛋白酶K溶液(0.01mg/mL)，按照6.3.2.3方法在37 ℃水浴中反应10 min后，离心后取上清液显色，检测酶活力。

6.3.4 蛋白酶K酶活力测定的最适温度的确定

（1）在以上试验基础上，以pH 8.0的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液分别配制牛血红蛋白溶液（1%）与蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL），按6.3.2.3方法，分别在27℃、37℃、47℃、57℃，67℃水浴10 min之后，离心后取上清液显色，检测蛋白酶酶活力。

（2）在以上试验基础上，以pH 8.0的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液分别配制牛血红蛋白溶液（1%）与蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL），按6.3.2.3方法，分别在52℃、57℃，62℃水浴10 min之后，离心后取上清液显色，检测蛋白酶酶活力。 6.3.5 蛋白酶K酶活力测定的反应时间的确定

在以上试验基础上，以pH 8.0的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液分别配制牛血红蛋白溶液（1%）与蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL），按6.3.2.3方法，在57℃分别水浴反应2，5 ，8 ，10 ，12 min之后，离心后取上清液显色，检测蛋白酶酶活力。

6.3.6 蛋白酶K酶活力测定的适宜酶浓度的确定

以pH 8.0的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液分别配制牛血红蛋白溶液（1%）与蛋白酶K酶液（0.25，0.05，0.01，0.002 mg/mL），按6.3.2.3方法，在57℃分别水浴反应10 min之后，离心后取上清液显色，检测蛋白酶酶活力。 6.3.7 商品蛋白酶K制剂酶活力测定验证

以pH 8.0的Tris-HCl缓冲液分别配制牛血红蛋白溶液（1%）与蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL），蛋白酶K分别来自Solarbio，国产蛋白酶K，Merck，Calbiochem公司。按6.3.2.3方法，在57℃分别水浴反应10 min之后，离心后取上清液显色，检测蛋白酶K酶活力。 6.3.8 蛋白酶酶活力计算

11

酶活力单位定义：在蛋白酶的最适反应温度和pH条件下，1 min水解蛋白质底物释放1 μmol显色呈福林试剂阳性的氨基酸的酶量，即为1个酶活力单位，以U表示。

酶活力计算公式：从L-酪氨酸标准曲线上读出样品的最终稀释液酶活力。样品的酶活力按下式计算：

A?4?V?n1X??M?m10X：样品酶活力 （U/g）；A：由L-酪氨酸标准曲线读出的最终稀释液酶活力（U/mL）；V：溶解样品所使用容量瓶的体积（mL）；4：反应体系试剂的总体积（mL）；n：样品的稀释倍数；M：L-酪氨酸的摩尔质量（181.20 g/moL）；m：样品的质量（g）；10：反应时间（min）。 6.3.9 重复性与数据统计分析

每个试验取两份平行样，每批试验以相同步骤进行3次重复测定。使用Microsoft ExceL97-2003工作表处理数据。

6.4 主要试验结果

6.4.1 蛋白酶K酶活力测定的底物的确定

图2酪蛋白对蛋白酶K酶活力测定的影响

根据图2，与其他底物测得的酶活力相比，在以酪蛋白为底物时，蛋白酶K

12