淋病的实验室检测

取淋球菌DNA提取液2μl，加入28μl的反应液中，最终PCR反应液中含dNTP各100μmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+

1.5mmol/L,加无菌石蜡油30μl，1000r/min离心30s，进行PCR扩增循环，反应条件：94℃变性1min，然后94℃

30s，57℃1min，72℃1min。共30个循环，最后72℃延伸5min。

扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳30min，溴化乙锭染色，紫外灯下可见扩增的DNA荧光条带，分子大小应与所用引物扩增靶序列的大小一致。 （4）PCR的灵敏性和特异性

由于CPPB在不含有隐蔽质粒的淋球菌染色体上也会含有CPPB基因，再加96%的淋球菌都会有隐蔽质粒，因此用CPPB作为靶序列的引物具有极高的敏灵性，实验证明，一般传统一步PCR（GC1-GC2）方法可以检出3个淋球菌，而用单管巢式PCR（GC2-GC4）可以检出≤0.3淋球菌（9个CPPB基因）。这些引物经特异性实验，只能扩增淋球菌的DNA，而对非淋球菌奈瑟氏菌扩增不出特异产物。

（5）单管巢式PCR方法

是在传统巢式PCR的基础上将两对PCR引物作特殊的设计，巢式外侧两个引物（GC1，GC2）为25b退火温度比较高（68℃），巢式内侧两个引物GC3-GC4为17b退火温度较低（46℃），PCR反应液的其它成分与一般PCR相同。这样，通过控制退火温度（68℃）使外侧引物先行扩增，经过20-30次循环后（第一次PCR），再降低退火温度（46℃）使内侧引物以第一次PCR产物为模板进行巢式扩增，该PCR的灵敏度可达到检出0.3个淋球菌。[dvnews_page=淋球菌连接酶链反应（LCP）检测方法]

（6）淋球菌连接酶链反应（LCP）检测方法

目前PCR检测淋球菌的方法被广泛地使用。其特异性，灵敏性不断提高。同时另一种基因诊断技术——连接酶链反应（LCP）也以其高特异，高灵敏性被应用于淋球菌的检测中。LCP 与PCR不同之处在于LCP

用四对引物，所用酶是连接酶。连接酶可以将两条相邻引物连接起来。连接起来的两条引物可以作为另两条引物的模板，后者在连接酶作用下连接，又可作为模板，如此进行30-40次循环。LCP所用的模板处理方法与PCR模板制备相等。LCP所用的探针除了可以设计在CPPB基因上，也可以设计在染色体基因序列上，例如opa-1基因。美国Abbott实验室在opa-1基因的48bp长的区域内设计了4个LCP探针，由于opa-1基因在淋球菌的染色体中有11次重复。因此，该组LCP探针具有高灵敏性和特异性。LCP反应过程： 将模板加入LCP反应液中，LCP反应液：20mmol/L

Tris-HCl pH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EDTA; 10 mmol/L NAD+;10

mmol/L DTT,有标记物的两个相邻探针各40fmol/L，未标记的探针各40fmol/L，15U耐热连接酶，反应条件：97℃1s，55℃1s，62℃50s，其40循环。100μl反应产物加入酶标板微孔中，进行显色反应，最后用酶标仪读取光值。根据Buimer的实验证明，LCP在检测男性尿道棉拭子标本的灵敏度为100%，尿液标本为88.9%，女性宫颈棉拭子标本为95.4%。LCP方法的特异性高达100%，这一点明显高于PCR的特异性，避免了假阳性的发生。 [dvnews_page=临床基因诊断淋球菌的注意事项] 3． 临床基因诊断淋球菌的注意事项

目前临床检测淋球菌的基因诊断方法主要采用PCR方法，但是该方法在临床检测中应注意几个问题。

（1）引物设计 除了以上所列的淋球菌PCR引物外，还可从在其它基因上设计，但

是引物序列应具有特异性。因为细菌的染色体较大，许多基因序列并没有搞清楚；同时细菌之间或近或远有一定的同源性，而且细菌所含质粒序列间也存在同源性，因此设计引物一定要进行基因数据库比较分析，同时进行特异性和灵敏性实验，从中选择引物进行临床检测。

（2）临床标本处理 对临床标本来讲，PCR模板要求越纯越好。这就要求在采集标本时要取到准确的位置，对于无症状患者要适当多采样，以保证采集到病原体细菌。另外由于临床标本成分比较复杂，有时简单处理的标本PCR扩增效果并不理想，这可能是由于杂质过多造成的,需要进一步纯化，如用酚一氯仿抽提法纯化，结果将会好转。这种纯化方法比较麻烦,目前已有商品化的DNA纯化试剂盒,可以较简便地从临床标本中提取高纯度的DNA。

（3）PCR产物的检测方法 不久以前临床PCR检测淋球菌几乎都采用电泳的方法进行PCR产物的鉴定。该方法存在许多问题，如由于肉眼观察的主观性而造成假阳性和假阴性的结果。目前用杂交显色法代替电泳法，提高了结果判断的特异性和灵敏性。

总之，PCR方法与LCP方法比传统的培养法在灵敏性和特异性上有了很大的提高，时间也大大缩短。随着基因诊断技术的不断改进。PCR方法与LCP方法在淋球菌的检测将会成为常规的检测方法。

（五）药敏试验：在培养阳性后进一步作药敏试验。用纸片扩散法做敏感试验，或用琼脂平皿稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），用以指导选用抗生素。

（六）PPNG检测：β-内酰胺酶，用纸片酸度定量法，使用Whatman I号滤纸PP-NG