WESTERN 操作过程

2.5.2 组织总蛋白提取

从超低温冰箱中取适量心脏和肝脏的组织样本(约100mg),放入1.5ml离心管中,每管中加入适量的RIPA裂解液(约10μl /mg，每1ml裂解液中加10μl PMSF)。在冰浴中用玻璃匀浆器将组织研磨匀浆。置于冰上裂解30min, 然后在再4℃, 12000g离心20min，将上清液小心移取至新的离心管中，-80℃保存。 2.5.2 BCA法测定蛋白质浓度

(1) 取浓度为5mg/ml的蛋白标准品,PBS稀释至终浓度为0.5mg/ml蛋白标准。

(2) 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液。 (3) 将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加RIPA裂解液补足到20μl。 (4) 加1μl的样品到96孔板的样品孔中，加RIPA裂解液到20μl；每个样品做两个重复。 (5) 各孔加入200μl BCA工作液，37℃孵育30min。 (6) 用酶标仪测量各孔0D值(562mn波长)。根据标准蛋白浓度梯度绘制吸光度值标准曲线,然后通过标准曲线计算每个样本孔的蛋白浓度。 2.2.3上样蛋白混合液制备

根据蛋白浓度测量结果,用ddH2O稀释各组蛋白样本,并加入蛋白上样缓冲液loading buffer (2x),使各组蛋白终浓度相同。混匀后煮沸5min,-80℃保存。 2.2.4 SDS-PAGE 电泳

(1) 洗净玻璃板,按照使用说明安装玻璃板和电泳槽。

(2) 根据蛋白分子量大小配制分离胶:HIF分子量为89kDa,用10%的分离胶;浓缩胶浓度是5%。浓缩胶和分离胶的配方见表2-8, 2-9。

(3) 积层胶凝固后,拔出梳子,清洗梳孔,将胶板放入电泳槽中,槽中灌满1xRunning Buffer。 (4) 上样:在第一个孔上蛋白Marker,后面各孔依次加蛋白样品15μl（约40μg）。

(5) 电泳:80V电压电泳,当溴酚蓝条带下降至两胶分界处时,将电压调制120V,直至溴酷蓝条带下降至分离胶最底端。

(6) 切胶：取出玻璃板，用小塑料撬板将两层玻璃板轻轻撬开，切去浓缩胶，并将分离胶切成适当大小，放入转膜液中浸泡10min。

表2.8 不同浓度SDS-PAGE分离胶的配制（5ml体系） 浓度 ddH2O 30%丙烯酰胺 1.5Mtris-HCl(PH8.8) 10%APS TEMED 8% 2.3 ml 1.3 ml 1.3 ml 0.05 ml 0.003 ml 10% 1.9 ml 1.7 ml 1.3 ml 0.05 ml 0.002 ml 12% 1.7 ml 2.0 ml 1.3 ml 0.05 ml 0.002 ml

表2.9 不同浓度SDS-PAGE浓缩胶的配制（5ml体系） 浓度 ddH2O 30%丙烯酰胺 1M Tris-HCl(PH6.8) 10%APS TEMED 4% 3.665 ml 0.66 ml 0.625 ml 0.05 ml 0.003 ml 5% 3.5 ml 0.825 ml 0.625 ml 0.05 ml 0.005 ml

2.2.5转膜

将PVDF剪成适当大小,并放入甲醇中浸湿,再将其浸入转膜缓冲液中。从玻璃板中小心取出分离胶。在半干转膜仪平板上依次放置事先用转膜液浸泡好的5层转膜滤纸、 PVDF膜和分离胶，胶上再放5层滤纸。擀除每层间气泡，盖上电极板和安全盖，25V恒压转膜25min。 2.2.6封闭

转膜结束后, 将PVDF膜浸入用PBS-T配制5%脱脂奶粉封闭液中。室温下在脱色摇床中封闭2h。 2.2.7 —抗孵育

用含有5%脱脂奶粉的PBS-T溶液稀释一抗。—抗浓度为1:500（Mb和VEGF为1:50），内参β-actin—抗浓度为1:8000。封闭结束后,将PVDF膜放入稀释好的抗体中,4℃摇床孵育过夜。第二天弃掉一抗后TBS-T溶

液洗膜3遍,每次10min。 2.2.8 二抗孵育

用含有5%脱脂奶粉的PBS-T溶液稀释二抗。目的蛋白使用抗兔来源抗体，浓度为1:3000（Mb和VEGF为1:1000），内参β-actin使用抗小鼠来源单克隆抗体，浓度为1：8000。室温摇床孵育1小时。孵育结束后弃掉二抗，用TBS-T溶液洗膜3遍,每次10min。 2.2.9 ECL系统显影

根据ECL使用说明，将A、B液等体积混合，取适量混合液滴到膜上，涂抹均匀后放入ECL凝胶成像系统中进行检测。 2.2.10图片分析

使用图像分析软件AlphaEaseFC分析Western blot图片的条带灰度值，根据目的条带与内参条带灰度值的比值来计算目的条带的相对强弱，从而反映目的蛋白相对含量。