PEG诱导细胞融合

山东大学实验报告 2011年9月16日

姓名 系年级 组别 同组者

科目 细胞生物学实验 题目 PEG诱导细胞融合 学号

【实验目的】

1. 了解动物细胞融合的常用方法。

2. 学习化学融合和电融合的基本操作过程 3. 观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化 【实验原理】

细胞融合，是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（如病毒诱导融合法）、化学方法（如聚乙二醇PEG诱导融合法）、物理方法（如电场诱导融合法）。

本次试验利用PEG诱导细胞融合，聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。

本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为: 1. 鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2. 实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。

【实验材料】 试剂：

1、Alsver’s液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，溶于100ml蒸馏水中。

2、0.85％生理盐水 3、GKN液：

NaCl 8g、KCl 0.4g、Na2HPO4·2H2O 1.77g、Na2HPO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g， 酚红（phenolrad）0.01g，溶于1000ml蒸馏水中。 4、50％PEG液：

实验前临时配制，根据需要称取定量PEG（Mw=4000），放入刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃等体积的GKN液，混匀。

器材：

显微镜，离心机，离心管，滴管，5ml量筒，载玻片，盖玻片

【实验步骤】

1

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将Alsever液与活鸡翼下静脉抽取的血混成1:4悬液 （抗凝效果最佳）

↓

4度冰箱保存 ↓

取上述悬液加入4ml85%盐水混匀 ↓

1200r/min离心5分钟 ↓弃上清

上述离心速率重复离心两次(5min, 10min) ,本次由于时间关系只做一次。 （用以去除细胞表面粘附物质的） ↓弃上清

加入1mlGKN液，配成10%细胞悬液 ↓取悬液

加3mlGKN液将红细胞的浓度稀释至每毫升1500万个 ↓取出1ml

加入 50%的PEG0.5ml混匀静置2分钟后混合均匀再静置2分钟 ↓

吸取1或半滴制片并镜检

2

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科目 细胞生物学实验 题目 PEG诱导细胞融合 学号

【实验结果】

观察到两个或多个细胞发生质膜融合但核尚未融合，有的则是细胞间不仅发生质膜融合，而且细胞核也发生了融合

图示细胞融合（照片截图）：

照片截图一刚开始融合

照片截图二开始进行核融合（但感觉此张有点像细

胞重叠而非核融合）

【实验结果分析.注意事项和讨论】

PEG法细胞融合的影响因素（也是看到较多细胞融合需主要的问题）：

1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。 2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。 3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。

4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。 5. 注意区分融合细胞与重叠细胞，此次试验观察到较多细胞聚集成团，可能是细胞悬液浓度略大或滴的量不合适所致。

3

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相关资料：细胞融合的意义与应用

细胞融合的意义

细胞融合不受种属的界限，可以实现种间生物体细胞的融合，是远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。

理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。

融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种的遗传物质交换提供了有效途径。

体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA也可以发生重组，从而产生新的核外遗传系统。

淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。

总之，细胞融合的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围。细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作。在技术和设备上没那么复杂，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视。

动物细胞融合应用

动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品。培育动物新品种，缩短动物的育种过程，动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，可别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成就。

虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但是在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对于研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。

1. 用于生产单克隆抗体

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