实验二细菌的芽孢染色, 鞭毛染色, 荚膜染色

08水产养殖 学号：060122008062 姓名：韦海明

实验 二 细菌的芽孢染色, 鞭毛染色, 荚膜染色

一 实验目的

1 学习细菌的芽孢染色法 2 学习细菌的鞭毛染色法 3 学习细菌的荚膜染色法

二 实验原理

1 芽孢染色的原理:

细菌的芽孢具有厚而致密的壁。透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色但一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则；除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

2 鞭毛染色的原理:

细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01～0.02μm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理、让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。

3 荚膜染色的原理:

荚膜是细菌分泌到菌体周围的一层黏液状物质,通常是多糖和多肽类物质. 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定。以免荚膜皱缩变形。

三 实验器材

1 菌种：培养24h的枯草杆菌（ Bacillcus subtilis） 、培养12-16h的变形杆菌斜面,培养3d的固氮菌。

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2 染色液和试剂： 5％孔雀绿水溶液、番红水溶液, 鞭毛染色液A液与B液，蒸馏水，香柏油，显微镜擦拭液,绘图墨水或黑色素溶液．

3 器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。

四 实验方法

（一）芽孢染色：

1 涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 2 晾干固定；待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过3次。 3 染色：

A 加染色液。加5％孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片用试管夹夹住，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽对开始计算时问，约维持４～５min。加热过程中要随时交替添加染色液和蒸馏水，切勿让标本干涸（加热时温度不能太高）。 B 水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 C 复染：用番红液染色２－３min。 D 水洗、晾干或吸干。

4镜捡：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽孢和菌体的形态。

（二） 鞭毛染色

１制片：吸取少量蒸馏水滴在洁净玻片的一端，无菌操作在斜面上取菌少许，在蒸馏水中轻沾，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端。用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。 2染色：

1）滴加 A液，染4～6min。 2）用蒸馏水充分洗净A液。 3）用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5～lmin (加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸)。 4) 用蒸馏水洗，自然干燥。

3 镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。

（三） 荚膜染色：

1 制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。 2 推片：取一清洁载玻片一端接触混合液，以30°角进行推片。 3 晾干：在空气中自然晾干。

4镜检：先用低倍镜、再用高倍镜、油镜观察。

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五 实验报告

1 绘出所观察菌种的芽孢和菌体的形态图． 2 绘出细菌鞭毛的形态及着生位置． 3 绘出固氮菌的菌体和荚膜的形状。

六 思考题

1 用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?说明原因.

答：能。因为芽孢难以染色，用简单染色法可以把易染上色的菌体染上色，而芽孢则没染上色，形成对比，因此也可观察到芽孢。

2 用鞭毛染色法准确鉴定一株菌是否有鞭毛,要注意哪些环节?

答：A．良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰老期培养物做鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 B．玻片要光滑、洁净（用洗衣粉洗），尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开）。这是染色的关键。

C．挑菌时，尽可能不带培养基。菌量要少。 D．掌握好B液的染色时间。

3 荚膜染色为什么要用衬托染色法?

答： 荚膜的成分多为多糖、糖蛋白或多肽，因此与染料的亲和力弱、不易着色，而且荚膜可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围便形成一透明圈。这样便可观察到荚膜的在菌体中的形状和位置。

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