Keap1-Nrf2通路在防御药物毒性中的防御机制

(GCLM) 应的速度为Vmax的一半时的底物浓度）代谢谷氨酸盐，升高代谢谷胱甘肽的反应常数K（即电离i离解常数，常数又叫电离平衡常数，用Ki表示） Glutathione peroxidases (GPX) Glutathione reductase (GSR) Glutathione synthetase (GS) (GST) Heme-oxygenase 1 (HO-1) Microsomal epoxide hydrolase (MEH) 以GSH为底物催化H2O2、有机过氧[52,53] 化氢物和脂质过氧化物的还原 催化氧化型谷胱甘肽 (GSSG)还原为[54] GSH 催化甘氨酸与γ-谷氨酰半胱氨酸结[55] 合 与亲电试剂结合 催化GSH[56-58] Glutathione S-transferases 降低GSH酸离解常数pKa，使血红素分解代谢生成胆绿素、一氧[59,60] 化碳和游离铁 使环氧衍生物和芳烃氧化物与水化[54,61,62] 合生成极性更强的邻二醇和反式-二 氢二醇 NAD(P)H:quinone oxidoreductases(NQO) Peroxiredoxin 1 (PRX1) Superoxide dismutases (SOD) Thioredoxins (TRX) Thioredoxin reductases (TRX-R) UDP-Glucuronosyltransferases (UGT)

催化孤对电子的还原和醌类化合物[6,63] 的解毒 过氧化氢物 催化超氧自由基的歧化作用以生成[65] O2和H2O2 催化二硫化物到巯基的可逆还原 [66,67] 通过催化硫氧还蛋白活性部位二硫[68] 键的还原，重新激活硫氧还蛋白 催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸[69,70] (UDPGA)与亲酯的底物结合 还原 H2O2、过亚硝酸盐和其它有机[64] - 5 -

图2 Nrf2在药物毒作用方面的保护功能：

注：药物经过代谢过程中的生物活化生成化学活性中间体例如醌类、环氧衍生物类和噻吩类。除非经过解毒，否则这些化学活性中间体能通过产生氧化压力或共价结合关键生物大分子包括DNA和蛋白导致毒作用。哺乳动物细胞进化出了通过上调解毒和抗氧化酶来对抗化学压力的感应和应答。这些过程由转录因子Nrf2介导，使Nrf2成为对抗化学活性中间体潜在毒作用，促进细胞存活的重要基因。

二、Kelch-Like ECH-Associated Protein 1(Keap1)

在没有细胞压力情况下，Nrf2通过它的抑制蛋白Keap1与Nrf2 Neh2结构域结合

锚定于细胞质中[15]。由于序列类似于果蝇细胞支架结合蛋白Kelch[71]，Nrf2的抑制蛋白命名为Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)（图3）。小鼠Keap1蛋白3个主要功能结构域见表3。哺乳动物细胞中Keap1通过与肌动蛋白组成的微丝骨架相互作用而锚定于细胞质中[72]，并在没有化学/氧化压力情况下抑制Nrf2活性[15,73]。Keap1的过表达下调Nrf2介导的依赖于ARE的基因的转录[15,73,74]。在化学/氧化压力情况下，Nrf2逃脱Keap1介导的抑制作用，通过Nrf2的Neh1结构域区的核转入信号（NLS）

[26]

在核内蓄积，从而激活依赖于ARE的基因的转录[15,73]。

图3 Keap1结构域

注：如图所示小鼠Keap1蛋白3个主要功能结构域BTB, bric-a-brac/tram-track/broad complex；干预区（IVR）, intervening region；双甘氨酸重复区（DGR）, double glycine repeat。每刻度表示Nrf2蛋白中的100个氨基酸。每个半胱氨酸残基均被标示。

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表3 Keap1结构域的功能和特征 结构域 BTB 67–178 功能和特征 Bric-a-brac/tram-track/broad 同源二聚体复合物 与 Cul3相互作用 IVR 179–321 干预区 酸) DGR 322–608 双甘氨酸（Kelch）重复区 [21,22,72,73,78] 与Nrf2相互作用 与肌动蛋白组成的微丝骨架相互作用 不同于Nrf2，Nrf1在细胞内的定位与活性均不受Keap1调控[29,79]。值得注意的是Nrf1蛋白比Nrf2蛋白大得多(小鼠Nrf1 741氨基酸对比Nrf2 597氨基酸)，Nrf1大多数比Nrf2多出来的残基位于蛋白N-末端[30]。一些残基形成了跨膜结构域，锚定Nrf1于内质网[29,79]，鉴于观察到Nrf1在转录激活形态分子量略小于未激活与细胞膜结合时形态，我们推测Nrf1在内质网应激(ERS)作用下经历了蛋白水解，使其在核内聚集[79]。因此，Nrf1和Nrf2活性被不同机制调控。

[72,76] 富含半胱氨酸(6.3% 氨基 参考文献 [75-77]

三、Keap1-Nrf2通路调控机制

尽管Keap1抑制Nrf2是Nrf2受抑制的重要原因，最近研究支持Nrf2的激活机制要比仅仅是从Keap1解离更复杂的观念，并提供了证据。

3.1 Keap1介导的Nrf2泛素化

在没有细胞压力时，Nrf2半衰期较短（10–30 min）[76,80-85]。更重要的是，蛋白酶体抑制剂抑制降解使得Nrf2蛋白稳定性提高和提高ARE调控基因转录活性的Nrf2蛋白核内聚集[7,49,76,80-88]。此外泛素化Nrf2也在没有细胞压力的情况下被检测到[7, 77,83,84]。这些证据表明Nrf2经过蛋白酶体通路迅速降解，导致Nrf2相对较短的半衰期及在没有细胞压力时的极低表达。

最近研究表明：类似于其它BTB家族蛋白[89]，Keap1作为依赖Cullin的E3泛素连接酶复合体的底物衔接蛋白[39, 76,77, 90]。Cullin蛋白(此处为Cul3)充当分子桥，分别结合底物衔接蛋白和底物(此处分别为Keap1和Nrf2)及招募泛素调控蛋白E2的ring-box

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蛋白Roc1/Rbx1[91]。从建立的细胞系的免疫共沉淀实验揭示Keap1与Cul3的结合[39, 76,77,

90,92]

和Keap1与Roc1/Rbx1的结合，结合位点在Keap1的BTB功能结构域[76,77]。通过

Cul3功能结构域突变或RNA干扰以抑制Cul3功能；结果是降低Nrf2降解及伴随而来的Nrf2基础表达水平升高，最终诱导ARE调控的融合报告基因的嵌合基因[76,77,90]。Cul3与Nrf2结合，通过依赖于Keap1的机制促进Nrf2降解[77,90]。复合诱变Nrf2在Neh2结构域中

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DLG31和79ETGE82模序的7个赖氨酸残基，有效地禁止了Keap1介

导的转录因子Nrf2的泛素化，提高了Nrf2的稳定性（半衰期延长2倍）；分别复原Nrf2赖氨酸残基上的突变后，Nrf2恢复泛素化过程[90]，表明Neh2结构域的赖氨酸对于Keap1介导的Nrf2抑制很重要。

在化学/氧化压力下，Keap1的泛素化蛋白酶体降解可能对减小Nrf2的抑制有作用

[92,93]

。事实上，在暴露于tert-butylhydroquinone (tBHQ )[84]，依布硒（ebselen）[94]后观

察到高分子量Keap1的形态形成。然而Cys-151的突变能抑制这种现象，表明Cys-151残基在感应促进高分子量Keap1复合物形成的分子中起到重要作用[84,94]。干预区（IVR）结构域的分子缺失能降低tBHQ暴露引起的Keap1泛素化[92]，质谱分析结果为Keap1的IVR结构域上的Lys-298残基的泛素化提供证据[93]。然而，不是所有Nrf2激活剂都诱导高分子量Keap1复合体的形成[92-94]。因此，在化学/氧化压力下Keap1泛素化应答的重要性还需要进一步探讨。

3.2 Nrf2磷酸化

尽管已经达成磷酸化是调控Nrf2的重要机制的共识，有证据显示一些分子可能通

过刺激某种蛋白激酶以诱导依赖于Nrf2的细胞防御通路。大多数研究是通过使用某种蛋白激酶的药物抑制剂来抑制Nrf2的诱导，以此证实磷酸化在调控Nrf2功能上的作用[95-100]。一个重要观点认为蛋白激酶的抑制无疑对多种信号通路有重要影响，而这些信号通路又可能影响Nrf2体系。一些小分子抑制剂被用来识别调控Nrf2活性的某种蛋白激酶，但这些抑制剂的特异性存在疑问[101-103]。然而独立研究表明，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)[95, 97,104]，细咆外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase-1, ERK1)[29]和蛋白激酶PKR-like内质网激酶（R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)[105]能直接磷酸化Nrf2。另外，文献最近报道Nrf2通过酪胺酸激酶（tyrosine kinase，Fyn）在Tyr-568位点的磷酸化是转录因子核内转出所必须的[106-109] 。化学抑制剂抑制或RNA干扰以耗竭Fyn或其上游调控基因糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β），均降低Nrf2核转出，提高ARE介导的基因的转录活性[106-109]。因此，磷酸化是Nrf2激活和减活的重要信号。然而，我们并不明确：特异性诱导剂是否诱导特定的激酶通路，还是依赖于细胞或种属的不同；又或者所有Nrf2激活分子共同特点是诱导多种通路？

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