电生理实验常见问题解答

道的基因组成，基因在超极化时被激活。每个通道亚单位只有两个跨膜部分，并且和形成通道孔道的P-区域相连接。第二类编码选择性钾通道的基因家族的亚单位有两个形成孔道结构的重复。这些通道也对静息时钾离子的传导力有贡献。

分子生物学研究的快速发展快速引发了对其他的一些离子通道基因家族的证实。这些家族包括氯离子通道，氯离子通道对于确定神经和肌肉细胞静息电位以及确定一类由ATP激活的配体门控型离子通道（这类通道在特定的突触上有神经递质的作用）都是很重要的。对这些离子通道的基因测序将揭示更多的通道家族。

由于通道是由许多亚单位组成，因此亚单位在结合时不同的变化就会使离子通道显示不同的功能特性，通道的种类也非常多。在神经元中已知就有超过12种类型的离子通道，并且每种离子通道还有几种密切的亲缘关系的构型（同分异构体），它们的差别在于通道开放和关闭的速度以及对不同激活信号的敏感性。离子通道的多样化是两种或多种有密切的亲缘关系基因的表达和mRNA从同一个基因转录后选择性地剪接或对mRNA的加工这些因素共同造成的。和酶的同分异构体一样，离子通道类型的变化在特殊的发育阶段，在大脑中的不同的细胞类型中，甚至是同一细胞的不同的区域都有着不同的表现。离子通道结构和功能的微妙的变化使得离子通道功能高度专一。 近年对于线虫Caenorhabditis elegans整个基因组测序工作强调了多细胞有机生物的离子通道的复杂性。这个基因组包括编码电压门控钙通道的五个基因，编码选择性钾通道的60多个基因，编码配体门控型通道的90个基因，以及编码选择性氯通道的六个基因。在这个基因组中没有编码电压门控型钠通道的基因。

不同细胞上的丰富的离子通道类型使得对于发展作用于神经系统选择性区域上的离子通道的激活和阻塞的药物成为可能。这种药物理论上应该具有最大的治疗效果和最小的副作用。

因为你是刚开始做，建议你严格按步骤做，同时尽量将你的实验条件也严格化，这样有利于你在实验中寻找导致问题的关键所在。

1、水尽量用好些的，双蒸水甚至三蒸水，有去离子水更好——以排除水中的离子杂质对脑片活性的影响。

2、在称量药品时尽量精确，药品用分析纯，有条件用国外的更好。

3、有条件的话PH值和渗透压都要测一下。渗透压有专门的渗透压仪检测，可以看看别的实验室有没有，借用一下。

4、灌流的acsf配好后就持续给混合气，不要到记录时才给。灌流的速度可以参考相关文献，有的文献有报道。使用别人已经比较成熟的记录槽。

5、记录系统方面，如果你的放大器是使用多年的，按说明书将放大器调试、校正到最佳状态。但如果最近有人用这个放大器做过类似实验，而且记录很好，可以暂不调试。当然这个最好在熟悉该仪器的技术人员指导下进行。

6、微电极不仅要测电阻，而且要在显微镜下量直径，直径要保证在1微米左右。内液要过滤，充灌要完全。如果你使用的是新电极，要先清洗后再使用。如果你的记录系统没有问题，而且脑片活性很好，即使1－2M的电极，也能记到电位，不过记到的是single unit还是field potential就不好说了。 建议你根据文献和别人的经验，与你的步骤一步一步推敲。你能够保证某个实验条件严格，就可以排除这个条件可能造成的干扰，而把矛盾的焦点对准最可能的地方。

记住，你现在是在做一项已经成熟的技术，就尽量按成熟的技术来，不要随便改变其中的步骤或参数。等条件摸索好了，你就可以按你的设想进行你的实验。

首先，你使用的ACSF必须事先通气（20-30分钟）使之饱和，然后才可以进行灌流；气体流量不好说，一般性语言描述为有一到三处连续不断的气泡冒出来即可，对脑片的供氧能

力主要还取决于灌流速度。

给药方式，在脑片上用循环给药一般说来都是比较慢的；如果你想快一点，可以在入水管上接一个三通，一边是正常溶液，一边是加过药的溶液，估计一下从三通到chamber的管子体积，根据流速计算一下药物流到chamber去的时间，wash也同样。

你是做的细胞外的话，加药还有种方法。就是用多管微电极。一般有三管、五管和七管。中心管用做记录，充灌电极内液。其他管里充灌药物，通过电泳使其作用到记录的细胞附近。有这种毛坯卖。不过这种方法也有缺点，容易使记录不稳定。

现在有专门的加药系统，可以多种药物快速微量给药。下面这个是华工仪博代理的加药系统：http://www.yibo.cn/prodb.htm 如果经费允许，可以考虑。单细胞记录有用Y管加药的方法。Y管的分叉一头给药，一头给持续的负压。药物从Y管的直管进入培养皿。注意要先给负压，再给药，使Y管充满药物，再将Y管扎入细胞附近。

我不记得你是否说过你们的记录时温度是多少。但要记录自发放电的话，一定要保证记录槽的温度在32度以上。不管是在体还是离体，记录自发都是对温度有要求的。在体要在37左右，离体在30到32以上，才可能记录到自发放电。昨天一个耶鲁大学的教授来我们这里也提到温度对自发放电影响的问题。

1、因为记录前已经孵育了1－2h，你的记录槽的温度又是在32度，如果细胞没有问题，应该几分钟后脑片适应了局部环境就可以记录到放电。

2、脑片境界变模糊——我也觉得是脑片活性不行了。在我做的海马脑片上，好的脑片低倍镜下可以看到分层清楚，细胞带有折射，皮质可以看到黑色点状的细胞。CA3的细胞比较大，耐受力差些，过半个小时到1h很明显看到CA3细胞带均匀透亮。这时高倍下看CA3细胞大都肿胀。你的这个情况可能和记录槽有关——我觉得。流速、氧饱和上次都说过了。还有就是浸没液面不要太低，刚刚盖住脑片是不够的。如果你的acsf有问题，在孵育时状态就不行了，不会到记录槽时才出问题。

3、每次实验完器皿的清洗也很重要。不知你们的灌流是怎么做的。我们给记录槽灌流用的蠕动泵上的硅胶管每次都要用蒸馏水和75酒精各灌洗一遍。孵育和灌流用的烧杯由于在室温下放置较长时间，也很容易长细菌，糖盐很容易在杯底沉积。每次实验完一定要洗干净。否则下次实验你再准的acsf经过这样的烧杯和灌流管渗透压和ph值也会变的。

4、如果你现在想验证脑片状态怎么样，自发记不到的话你可以试试诱发。给刺激看看有没有反应，有的话看看反应持续时间和反应表现。建议你查查文献，看看你记录的细胞的电生理特性是怎样的。

我也觉得和灌流槽有关，因为我测了一下ph，发现烧杯内氧饱和的acsf和最后流出的acsf 的ph基本上很接近，且接近7.4，惟独灌流槽小室内液体ph要偏高点。我用的是全浸式脑片灌流槽，所以我怀疑小室内液体得不到充分交换，甚至有的一点也不交换。不知你那边用的是什么样的灌流槽？我老板说实在不行就换灌流槽。如果记录细胞外自发放电，你觉得用全浸式的好还是用半浸式的好？

我们用的是自制的全浸式记录槽，用的挺好。附件是它的示意图，供你参考。但灌流槽ph值偏高也有可能和你的流速有关：如果流速过慢也会造成交换不好。

记录细胞外单位放电中，为了保证记录的电位是单个细胞的活动，要尽量将电极拉细。电极尖端越细，记录的放电越有可能是单个细胞的活动。看放电是不是单个细胞的活动，可以看示波器上的放电的幅度是否接近一致。放电幅度长长短短的那就是记录到多个神经元的活动。有时你仔细观察，还可以发现长短放电各有各的规律。同时****也可以发现放电

的声音不一致。如果放电幅度基本一致，频率有变化。这有可能是单个细胞的活动。因为你记录的脑片中的神经元，它接受多个突触的信息，因此它的放电可能不一定十分规律。

whole－cell recording的液接电位的补偿问题

我们一般都是在电极入水后补偿液接电位。但在下电极的过程中有时基线还在波动，有时还很大。按理说当形成giga－cell后，就不能在调节pipe－offset了。但是，当形成巨阻封接后，电极内液和浴液之间的接触就隔断了，然后吸破形成whole cell。这个时候液接电位就消失了。但你入水时已经补了这个液接电位。也就是说形成whole cell后多补了液接电位大小的电压。你记录的电位是实际电位加上液接电位的值。很多人电极内液都是用的葡萄糖酸钾，用axon的液接电位计算公式算的葡萄糖酸钾版的电极内液和外液的液接电位都是10mv以上。这个时候误差就大了。这就产生个问题：这个液接电位怎么补？什么时候补？不补的话你钳制电压应该钳多少，电流钳下记录的膜电位与实际膜电位差多少？请大家说说各自的液接电位补偿的做法和理由。

这是一个不错的问题。

首先，让我们来看一看offset这个电压是怎么来的。他的来源很广泛，一部分是恒定值，比如放大器的输入offset；一部分是变化值，比如液接电位，它依赖于离子成分；一部分由附加环路产生，包括玻璃电极、试验浴槽或者是氯化银电极；还有一部分是膜片钳放大器产生的。我们调节offset，是把这个电压在放大器里加到command电压上了，从而使得在command电压为零的时候电流也为零。 液接电位在入水的时候有，一旦形成巨欧姆封接或者吸破后就不存在了，所以这一部分电位差值有必要考虑进去。

我一般的做法是入水之后补offset，一旦开始封接（>30M）就不再进行补偿，直至形成巨欧姆封接。在这个过程中，液接电位已经加到command电压里头去了，所以在吸破后测量其膜电位（电流钳）的时候，要将液接电位减去，比如测出来是-50mV，减去液接电位（以+10mV为例），就变成了-60mV。在电压钳模式下的钳制电位也是一样要补上一个液接电位差值的，比如command电压是-60mV，实际输出是-70mV。不知我理解得对不对。

关于这个问题，axon的说明书里有比较详尽的补偿方法。

我用的灌流槽就中间一个小室，而且体积蛮大的。液体从小室下面进来，到达一定高度后从周围小孔出去。理论上来讲里边的液体应该可以得到充分交换，但不知为何小室内液体的ph要高于流入的和最后流出的acsf。而且液面比较高，控制不好的话脑片会浮起来。不过我设定的流速并不慢，我用的是蠕动泵灌流，流速在4ml/min左右。还有就是温度控制的不稳定，不知你用的那种全浸式灌流槽如何来控制这些问题。因为我觉得这两个问题直接影响了我能否记录到脑片的自发放电。我这两天做了几次，都能记录到自发放电，但持续时间不长，最长的也就2小时左右，短的只有半小时。不知你以前记录的时候一般能维持多少时间，怎样才能使脑片的活性维持较长的时间？

我自己没有做过成年鼠的脑片。不过我觉得是先分离海马再冰冻。但是如果没有冻过，脑组织很软，可能不太好分离。我想可能要先将脑组织冻1－2min在分离比较好些。这样一是组织有些硬度，比较好剥离海马；二是降低组织温度，减少神经元损伤。剥离时最好在冰板上进行，中间要加些4度ascsf保持组织湿润。

有人在做成年鼠脑片前是用冰冻的氧饱和的ACSF心脏灌流的。这样可以降低脑组织内部温度，你在剥离海马时神经元的损伤就小一些，从而提高海马神经元的存活率。

液面和你的记录槽齐平就可以了，太高会溢出可能漏到显微镜系统里；太低交换不好。脑片可以用白金丝做的U型框粘上尼龙丝来压（陈军的那本书里有介绍怎么做），你也可以将尼龙网粘在白金框，或者银丝也可。你粘尼龙丝时候隔2－3mm粘一根，这个距离够你下电极了，不会说到做的时候还要调整尼龙网的位置。

至于为什么从孵育槽到记录槽要等1h才能记录到自发放电，我也不太清楚。不过我觉得应该要不了那么长时间。是不是你的记录槽液体交换慢了点，适当快点，混合气早点充——再试试看。

从你现在的情况看，切片估计不是问题了。不知孵育中可能的问题你注意没有：首先还是要给acsf预先给予混合气进行饱和；其次，在孵育时注意在尼龙网下不要形成气泡——可能造成脑片底部与液体接触不良；脑片在网上要平摊开，脑片之间最好不要覆盖和折叠。

我觉得由于你们这种记录槽液体是从底部流入，可能会造成脑片飘，记录不稳。6mm的高度有些高了，我们的记录槽大约3mm高，太高对显微镜成像效果会有影响。还有，你们的记录槽液体是自下向上流，那么脑片深处得到的氧饱和acsf就好一些，越往上交换过的acsf就多一些。而且你们的槽子这么深，积累的废液也相对多些。或者这么说，同样的流速，6mm深的记录槽液体和气体交换的时间要长于3mm的记录槽，这可能会影响到脑片在记录槽中的活性。而你要是加快流速的话，又会加剧脑片的飘荡，影响记录的稳定。所以，我觉得你的记录槽需要改进。要不降低高度试试，要不用我上次说的那个记录槽。不过用我说的记录槽，你的加温系统不知能不能上上去。

应该每个海马的锥体神经元都可以记录到0.1 mM glutamine 诱导的电流的，不知你是想记***AR介导的电流，还是AMPAR/KA介导的电流，如果是前者，应该用无Mg2+溶液和1~3 微摩尔的gly才可以记录到。另外，你配好的glutamine溶液要注意pH的变化，可能会偏酸，而H+对glutamine电流是抑制的。

model cell实际就是模拟patch记录的三个阶段: 1、电极入水。电路上就是一个10M的电阻；2、巨阻形成。电路上是1个10GM的电阻；3、whole cell形成。电路是一个500M的电阻和一个电容构成的回路。三种状况均可在seal test窗口中看到。seal test和你给step 刺激一样，都是在model cell上加个电压，窗口显示了记到的电流大小。同理你也可以在电压钳下给step，利用欧姆定律自己根据给的电压和记到的电流算电阻。这个值可能不会那么标准就等于三种状态下的电阻，这与仪器自身的噪声及性能有关，但不会有太大的偏差。如果偏差很大，比如应该为10M只记到5M，可能里面有问题。这时你就要排除是model cell的问题还是放大器的问题。测model cel电阻排除一下model cell的问题。如果model cell没问题，对照说明书用它校正一下放大器。

最大的可能就是封接系统漏气。将电极固定在holder上，电极尖端烧闭。三通管与带电极的holder整体浸入水中，从三通管给气体，看三通管、三通管与软管连接处、软管与holder连接处等易于漏气的地方是否有气泡冒出。如有，用胶将其封闭，或者换新管。

还有一种可能就是电极堵了，不过电极堵的话电极电阻会有较大的增加，很好辨认。

电极内液是在入水之前灌充的，一旦钳制以后，可能就不能更换了，因为一旦更换，就不可避免引起振动，这是膜片钳实验的禁忌之一，很容易引起细胞的死亡。另外，关于渗透时间的问题，我曾经特意作过time-course，通常电极内液完全渗透到细胞内，使电极内和细胞内达到平衡大约在5min左右，有时候因为负压大小或其他的原因，可能大于或小于5min，虽然没有作过氨基酸，但是时间也是差不多的。

1、如果你考虑与鼠龄有关，建议你查查有关大鼠发育的文献，看看你所做核团是在生后多少天发育成熟。也可以参考做该核团的文献，看看别人用多大的老鼠。（我个人认为觉得20d应该没有问题） 2、渗透压不知是你计算的还是实际测量的。有人提出渗透压略高一些还有利于细胞的长时间存活，甚至有人孵育时用高渗的蔗糖脑脊液，记录时用正常脑脊液。你可以参考别人的文献，适当调整一下方子。这个要靠你自己摸索，各个实验室不一样。

3、孵育时氧饱和越充分越好。我们一般都事先给孵育槽里充氧2h左右。因为混合气里co2比例一定，