微生物实验（讲义） - 图文

（二）器皿包扎

为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿均需包扎。

（1）培养皿 洗净烘干后每12套迭在一起，用牢固的纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌。到使用时在无菌室中才打开取出培养皿。

（2）吸管 洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，及口中的微生物吸入管而进入培养物中造成污染。塞入棉花的量要适宜，棉花不宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉。每支吸管用一条宽约4－5厘米，以45°左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管。

（3）试管和三角瓶 试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过松，过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口。

（4）若干试管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。

2、制备培养基

（1）计算称量 根据牛肉膏蛋白胨的配方，牛肉膏 3克, 蛋白胨10克, 氯化钠 5克, 琼脂20克, 水 1000毫升, pH=7.0-7.2。计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称(量)取。

（2）溶解 一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解(但在配制化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想)。加热溶解时，要不断搅拌（本实验培养基的配制不需加热溶解）。如有琼脂在内，可先将称量好的琼脂先放入三角瓶中,实验时可先将药品放入烧杯中溶解,之后定容,再调节pH值,之后再将该溶液倒入装有琼脂的三角瓶中。

（3）调节pH 用滴管逐滴加入NaOH或HCl边搅动；边用精密的pH试纸测其pH

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值，直到符合要求时为止。pH值也可用pH计来测定。

（4）过滤 可用四层纱布过滤。之后将配制好的溶液加入三角瓶中，先用四层纱布盖好三角瓶瓶口，再用报纸盖在其上，最后用橡皮筋固定。

3、斜面培养基的制作

将配制好的牛肉膏蛋白胨培养基放在电炉上加热,将琼脂完全溶解,趁热放入漏斗中进行分装,每支试管的量约2-5毫升.试管灭菌后,趁热斜置在木棒上,使试管内的培养基斜面长度为试管长度的1/3-1/2之间,待培养基凝固后即成斜面.

4、灭菌

（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121℃，20-30分钟灭菌。

（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

（6）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

5、 倒平板

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右手持盛有培养基的三角瓶置于酒精灯火焰旁边，用左手将试瓶塞轻轻地去

（拨）出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15-20 ml培养基至培养皿中，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

五、注意事项：

1、 加水：向锅内注入适量的水。

2、 装锅：注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试

管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3、 排气： 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为

重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。

4、 冷却：让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀。 5、 干热灭菌：一般在电烘箱中进行。干热灭菌所需温度较湿热灭菌高，时间也较

湿热灭菌长。这是因为蛋白质在干燥无水的情况下不容易凝固。一般须在160℃左右保持恒温3～4小时，方能达到灭菌的目的。干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌，凡带有橡胶的物品和培养基，都不能进行干热灭菌。切断电源，冷却到60℃时，才能把箱门打开，取出灭菌物品。

六、思考题

1、为什么温热比干热灭菌优越? 2、培养基中加琼脂的作用是什么?

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3、如何检验培养基灭菌是否彻底?

4、灭菌结束之后，为什么要等压力降到“0”后才能打开放气阀？

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