微生物实验（讲义） - 图文

2、使用血球计数板计数

计算公式如下： 16×25计数板：

总菌数/ml=100个小方格内菌数100×400×10000×稀释倍数

=每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数 25×16计数板： 总菌数/ml=80个方格内总菌数80×400×10000×稀释倍数

=每小方格内菌数×4×106×稀释倍数

三、材料和器皿

材料：酿酒酵母、显微镜、血球计数板、盖玻片 器皿：移液管、枪头

四、实验内容及操作步骤 1 总菌计数法 (1) 检查血球计数板

取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。 (2) 稀释样品

将培养后的酵母培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。 (3) 加样

取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。用滴管取1滴菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。静置5—10分钟。 (4) 镜检

静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右

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下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。每个样品重复3次。 (5) 计算

取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升菌液中的含菌量。 菌体细胞数（cfu/mL）＝小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数 (6) 清洗

计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。

(7) 测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

五、实验结果 第一次 第二次

六、思考题:为什么用两种不同规格的计数板测定同一样品时,其结果一样?

中格 X1

X2

X3

X4

五中格平均

(X5) 值

1 1 稀释倍数

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实验四、培养基的制备及灭菌

一、实验目的

1、了解玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作 2、掌握培养基和无菌水的制备

3、了解高压蒸气灭菌锅的结构、原理及学会使用

二、高压蒸气灭菌锅的原理

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，是灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量。这种潜热能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效果。

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于冷空气的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。

三、仪器与材料

仪器：高压蒸气灭菌锅、天平、烘箱、洁净工作台 材料：牛肉膏蛋白胨培养基 试剂：NaOH

器皿：三角瓶、试管、硅胶塞、量筒、玻棒、烧杯、精密pH试纸、药匙、分装漏

斗、试管盒、纱布、报纸、麻绳、标签、培养皿等

四、实验内容及操作步骤

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1 玻璃器皿的洗涤及包装

为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。因此应看作是微生物实验的基本操作。

（一）器皿洗涤的注意事项和方法

（1）任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，所以不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。

（2）一般新的玻璃器皿用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水冲洗干净。 （3）用过的器皿应立即洗涤，有时放置太久会增加洗涤困难。

（4）难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起。有油的器皿不要与无油的器皿放在一起，否则使本来无油的器皿也沾上了油垢，浪费药剂和时间。

（5）强酸、强碱、琼脂等腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废缸内。

（6）含有琼脂培养基的器皿，可先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮去，或把它们用水蒸煮，待琼脂融化后趁热倒出，然后用水洗涤。

（7）一般的器皿都可用去污粉、肥皂或配成5%热肥皂水来清洗油质很重的器皿，应先将油层擦去。

（8）如果器皿沾有煤膏、焦油及树脂类的一些物质，可用浓硫酸或40%的氢氧化钠液洗，或用洗涤液浸泡。

（9）当器皿上沾有蜡或油漆等物质，用加热方法使之融化揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、丙酮、松节油等）拭揩。

（10）洗涤后的器皿达到玻璃能被水均匀湿润而无条纹和水珠。

（11）载玻片或盖玻片可先在2%盐酸溶液中浸1小时，然后在水中冲洗2－3次，最后用蒸馏水洗2－3次，洗后烘干冷却或浸于95%酒精中保存备用。用过的载玻片或盖玻片，先擦去油垢，再放在5%肥皂水中煮10分钟后，立即用清水冲洗，以后放在洗涤液（稀释）中浸泡2小时，再用清水洗至无色为止，最后用蒸馏水洗数次，干后浸于95%酒精中保存备用。

（12）凡遇有传染性材料的器皿，洗涤前应经高压灭菌后清洗。

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