浙科版选修1学案 - 图文

选修1 《生物技术实践》 实验1 大肠杆菌的培养和分离

1、细菌:

细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核。有一大型环状DNA分子（拟核）和多个小型环状DNA(质粒)，以分裂（二分裂）的方式繁殖。 大肠杆菌是: 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，代谢类型: 异养兼性厌氧型。 ( 菌体: 指细菌细胞 单菌落:单个细菌细胞在固体培养基形成的细胞群。芽孢: 细菌细胞休眠体)

2、 培养基

（1)培养基的基本成分：水、碳源(提供碳元素)、氮源(提供氮元素)、无机盐。 （2） 培养基的类型(按物理形态):

① LB液体培养基(用于菌种的扩大培养) ②LB固体培养基（用于分离菌种和保存菌种） （3）培养条件: 适宜的PH、温度、溶氧量、渗透压等 （4）培养基的配置:“细菌喜荤，霉菌喜素”

① 细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的

渗透压，PH为中性偏碱；

② 霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可，PH为中性偏酸 。 (5)培养条件: 适宜的PH、温度、溶氧量、渗透压等

3、无菌操作

(1)目的要求:防止所利用的微生物被其他微生物(杂菌)污染 (2) 无菌操作过程:

①各种器皿和培养基必须是无菌的，用高压蒸气锅灭菌 [121 0C，1kg/cm2 ，15min] 灭菌；接种环也必须无菌,可以灼烧灭菌

②转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无杂菌污染，在超净台（打开紫外灯和过滤风，灭菌30min）上酒精灯火焰旁操作。转移时培养基不能沾在皿壁和瓶口上。

③棉花塞的制作标准:棉塞周围没有皱褶和缝隙，容易拔出，但手提棉塞时，三角瓶或试管不能落下来。其中棉花用非脱脂棉（为什么?）。

④实验中使用过的器皿、培养基都需经过灭菌后才能清洗。

4、细菌的分离方法有两种：

划线分离法和涂布分离法。这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

(1) 划线分离 用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上连续划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少，划线到最后，可使细菌间的距离加大。将划线接种后的固体培养基培养12～24小时后，一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞，形成单菌落。划线分离的标准是: 划线末端出现不连续的单个菌落。

(2) 涂布分离 先将培养的菌液稀释，通常稀释到10-5～10-7之间，然后取0.1ml不同稀释度的菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面后进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。 比 较 过 程 培养—分离出单菌落 分离的标准 划线末端出现不 连续的单个菌落 培养皿中有20 特 点 方法简单 划线分离法 接种环灼烧灭菌 - 划线分离接种 --倒置涂布分离法 稀释菌液 -- 滴加菌液(0.1ml)--涂布分离接1

操作复杂，单菌

种---倒置培养--分离出单菌落 个以内的单菌落 落更易分离 (3) 固体培养基进行恒温培养时，要将培养皿倒置: 防止培养皿盖上的水滴，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落达不到分离的目的。

5. 大肠杆菌的培养和分离

实验材料: LB液体培养基配制、调节PH，LB固体培养基（LB液体培养基+琼脂）配

制、调节PH，大肠杆菌菌种斜面、空白斜面(用于保存菌种)

实验步骤:

① LB培养基的灭菌: LB液体培养基、LB固体培养基高压蒸气锅灭菌1kg [121 0C]有压力后开始计时灭菌15min。

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② LB固体培养基：灭菌的培养基60 C时，在超净台的酒精灯火焰旁，倒入培养皿，制平板。

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③菌种扩大培养:把试管中固体斜面菌种接种到LB液体培养基中，37C摇床上振荡培养12h。 ④划线分离: 用接种环醮扩大培养的菌液一次，多次划线分离，37 0C倒置培养12--24h后，

观察分离的单菌落。

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⑤存留菌种:把分离的单菌落划线接种到试管空白斜面，37 0C培养24h后，4C存留菌种。

实验2 分离以尿素为氮源的微生物

一．实验原理: (1)脲（即尿素）是人和哺乳动物体内蛋白质降解的产物，农作物不能直接吸收利用，土壤中有的细菌含脲酶: (NH 2)2 C=O + H2O 脲酶 2NH3 + CO2 (2 )比较：选择培养基（尿素为唯一氮源）和LB全营养培养基(作对照) 的菌落数。 二、实验目的: 利用尿素为唯一氮源的选择（固体)培养基来分离土壤中含脲酶的微生物，并了解它在生态平衡中的作用。 三、实验步骤：

1、制固体培养基:

（1）LB全营养培养基: 配置--灭菌--倒平板

（2）尿素固体培养基(选择性): 配制（葡萄糖 + NaCl + K2HPO4 + 琼脂糖 + 酚红）→

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灭菌→ 60 C时，用G6玻璃漏斗过虑加尿素溶液 【酚红:遇酸黄色、遇碱(NH3)红色】

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2、制备细菌悬液: （哺乳动物排泄物处)土样 + 无菌水→取悬液稀释10、10 。

-5

3、涂布分离法分离细菌。取10-4、10 稀释液各0.1ml，分别加到有LB固体培养基和尿素培养基的培养皿各三个，用玻璃刮刀在灯焰旁涂布到整个平面。

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4、倒置培养。37 C恒温箱培养24-48 h,观察分离的单菌落数。

5、观察结果: 全培养液中单菌落数多，尿素为氮源的培养基平板中单菌落很少。 【实验过程归纳】

培养基配制、灭菌和倒平板→土壤取样→样品的稀释→涂布分离微生物→菌落的培养与观察。

实验4 果汁中的果胶和果胶酶

一、酶是生物体中生化反应的催化剂。催化反应是在常温常压下进行，而且快速、专一。 二、果胶是植物细胞壁的主要成分之一

(1)组成：由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯聚合而成高分子化合物。山楂果实中果胶含量较多。

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(2)功能: 果胶使植物细胞粘合在一起，并可结合大量的水分。去掉果胶会使植物组织变得松散，有利用于果汁的形成，可提高出汁率和果汁变澄清。

(3) 特性: 果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。 三、实验原理:

(1) 果胶酶和果胶甲酯酶可水解果胶生成半乳糖醛酸，使植物组织变的松散，有利于果汁的形成，提高果汁的出汁率并使果汁澄清。果胶不溶于酒精，是鉴别果胶的一种简易方法。 (2) 可根据产生的果汁量及果汁的澄清度、果汁中果胶的剩余量来表示这两种酶的活性大小。果胶酶和果胶甲酯酶的活性受温度、PH等环境因素的影响。

某些真菌细胞（如黑曲霉、苹果青霉等）可生产并分泌果胶酶。 四、实验目的:

1、探究果胶酶在果汁制作中的作用 2、检测果胶酶的活性的影响因素（温度） 五、实验步骤:

【问题】果胶酶在制作果汁中起什么作用？ 果胶是细胞间的黏连成分，也是果汁中的成分， 加入果胶酶可将细胞离析，增加固形物的分散度。此外还降低了水果匀浆悬液的黏度，有利于过滤掉不溶物，并使果胶分解成半乳糖醛酸。

实验6 α—淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

一、固定化酶

(1)概念: 将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

(2)方法: 有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。

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① 吸附法 ②交联法 ③包埋法 ④共价偶联法

(3)优点：①使酶固定化后有一定的机械强度，催化反应的过程可管道化、连续化和自动化；②酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易纯化；③固定化酶可反复使用，更经济，更利于工厂化生产；④固定化酶提高了酶的稳定性。可较长时间地贮存和使用。

二、实验：α—淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

1、实验本实验内容 是用吸附法将α—淀粉酶的固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。

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【实验用枯草杆菌生产的α-淀粉酶，最适PH为5.5--7.5，温度为50--75 C 】 2、实验步骤

1、α-淀粉酶的固定化。5mg α--淀粉酶溶于4ml蒸馏水，加入5mg石英砂搅拌，30min后装入含气门心并用夹子封住的注射器中。用40ml(10倍体积) 蒸馏水用流速1ml/min来洗涤除去未吸附的游离淀粉酶

2、使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱，在流出5ml后接收0.5ml流出液，加入1-2滴KI-I2溶液，观察颜色变化。

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3、10倍柱体积的蒸馏水洗涤，冰箱4 C存放，几天后重复实验。

【实验流程归纳】

固定α-淀粉酶(吸附法) → 滴管滴加淀粉溶液→加KI-I2 溶液→观察→洗涤，几天后重复实验

实验8 果酒及果醋的制作

一、1、酿酒和制醋有关的微生物分别是酵母菌（真菌）和醋杆菌（细菌）。 2、果酒制作的原理: 先将淀粉水解成葡萄糖；酵母菌先需氧呼吸扩

增菌种，后在无氧条件下，厌氧呼吸将葡萄糖氧化成乙醇，当乙醇浓度超过16% 时，酵母菌会死亡。

C6H12O6+6O2+6H2O 酶 6CO2+12H2O+能量 C6H12O6 酶 2C2H5OH+2CO2+能量

二、实验过程:

(一) 用葡萄制作葡萄酒的实验流程

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