丁香活性物质提取工艺优化与抗氧化活性研究

第1期 江慎华等：丁香活性物质提取工艺优化与抗氧化活性研究

__ 7000

9000

135

% W6000

5000 褰 14000 |#3000

^^2000

抿班丨000 0

乙醇体积分数/%

(a)

?7m8000 1^7000 g c 60〇〇 g ? 5000 1^ 4000 ^§ 3000 g| 2000 1000 0

提取温度/■〇 0>)

Fig.l

图1 丁香抗氧化活性物质提取工艺单因素试验结果

Results of univariate experiments for extracting antioxidants from clove

2.2 丁香抗氣化活性物质提取正交试验结果

根据单因素试验确定的四因素三水平的正交试 验结果如表3所示。由该表可以看出影响丁香抗氧 化活性物质提取率的因素从大到小排序依次为乙醇

体积分数、料液比、提取时间和提取温度，最佳提取 工艺为A、B2、C3和1)2,即60%乙醇、提取温度 60丈、料液比1:20和据取时间40 min。

*3 丁香抗氣化活性物质提取的正交试验结果

Tab. 3 Orthogonal experlmente of extracting antioxidants from clore

试验序号 1 2 3 4 5 6 7

A B C D 1 1 1 2 2 2 3 3 3 9137.733 9 691.9 7 145.9 2 546

1 2 3 1 2 3 1 2 3 8 517.067 9 030.067 8 428.4 601.666 7

1 2 3 2 3 1 3 1 2 8 048.4 8 466.4 9 460. 733 1 412. 333

1 2 3 3 1 2 2 3 1 8 216.233 8 900.233 8 859.067 684

8 9

抗氧化活性物质提取率/lUnobg7 943.9 ±67.2-1

9 558.9 ±40. 3 9 910.4 ±134.4 9 558.9 ±40.3 10 423.4 *161.2 9 093. 4 ±214.9 8 048.4 ±26.9 7 107.9 ±67.2 6 281. 4 ±214.9

惫2 ^3 R

正交试验方差分析结果如表4所示。由该表可 以发现正交试验4个因素的显著性水平均低于 〇.〇〇1。因此4个因素对试验的最终结果都具有极 强的显著性。按照最佳提取工艺进行3次平行验证 试验，最后测定的结果为（10 480.4 ±40.3) junol/g。 由此证明该最优提取工艺较为可靠，可以考虑作为 后续扩大提取工艺的提取条件。

2.3 丁香粗提物抗氣化活性的测定结果与分析 扣〇叫等[17]采用测定总还原力、FRAP法抗氧化 能力和DPPH自由基淸除能力等方法测定桔梗的抗 氧化活性并获得了良好的研究结果。本文采用以上 3种方法测定了丁香粗提物的抗氧化能力。

来源 表4 丁番抗氣化物质提取正交试验方差分析 Tab. 4 Analysis of variance of orthogonal experiments for

extracting antioxidants from clove 平方和 自由度 均方和 校正模型 0. 085(a) 8 0.011 截距 3. 330 1 3. 330 A 0. 030 0.060 2 B 0.004 2 0.002 C 0.017 2 0.009 D 0. 005 2 0.002 x 10 残差 0.000 9 4. 60 5~ 总和 3.416 18 校正总和 0.086 17 显著性 水平 232. 304 0.000 72 389. 570 0.000 647.755 0.000 38.121 0.000 190. 179 0.000 53. 161 0.000 尸比 在总还原力的测定结果中（表5)，50、100和

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136 农业机械学报 2 0 1 0 年

150 jtg/mL质量浓度范围内丁香粗提物在波长700 mn 处的 OD 值分别髙达 0. 153 ±0? 009、0. 299 ± 0? 005 和0.439 ±0.014 5,尽管在此质量浓度范围内其总 还原力均不及相同质量浓度的阳性对照BHT和VC (尸<0? 001或P <0? 01)，但丁香粗提物毕竟为混合 物，其中所含的杂质比较多，而阳性对照均为分析纯 的高纯度产品。如果进一步提高活性物质的纯度， 其抗氧化活性会得到极大加强。

FRAP法抗氧化能力（以沔3 nm处的OD值表 示）的测定结果表明（表5),丁香粗提物也具有很强 的抗氧化能力。在50、100和150叫/inL的质量浓 度范围内其593 rnn处的OD值分别高达0.208 ± 0. 012、0. 362 ± 0.

012 和 0? 429 ± 0. 001，150 ng/mL 的质量浓度时甚至和相同质量浓度的VC没有极显 著性差异（/><〇.〇〇1)。尽管质量浓度在50+^11^ 和100 fig/inL时其吸光度值极显著性低于VC (P < 0.001)，但均极显著性高于阳性对照BHT (P< 0.001)。由此结果可见丁香粗提物的强抗氧化活 性得到了进一步验证。

DPPH自由基清除率的测定结果表明（表5)， 质量浓度为50、100和150 pg/mL 丁香粗提物的清 除率分别为（66. 118 ± 0. 332 ) %、（ 79. 647 ± 0.832)%和（83. 294 ±0.666)%，尽管显著性低于 VC，但仍然高于 100 fig/mL 和 150 jig/mL 的 BHT (P <0.01和P <0.001)。可见丁香粗提物具有很 强的自由基清除能力。

表5 丁香粗提物抗氣化能力的测定结果

Tab. 5 Antioxidant activities of the crude extracts from clove

质最浓度 /p,g-mL_1

50 100 150 50 100 150 50 100 150

样品 BHT 0.291 ±0.004B

显著性

VC 0,417 ±0,005A丁香粗提物 水平

0,153i〇.〇〇9 c P<0.001 P <0.001 P <0.001 P <0.001 F <0.001 P <0.001 P<0.05 P<0.01 P <0.001

总还原力

0.518 ±0.006B 0. 602 ±0.034? 0. 144 ±0.014c 0. 299 ± 0.005 ^ 0. 439 ±0.015? 0. 208 ±0. 012? 0. 362 ±0. 012B 0. 429±0. 001A 66. 118 ±0. 332? 79. 647 ±0. 832B 83. 294 ±0. 666B

0.695 ±0.043A 0.913 ±0. 080A 0.444 ±0.011A 0.472 ± 0.023A 0.473 ±0. 024A 84. 353 ±0. 166 A 94. 706 ±1. 165A 95.294 ±0.333 A

FRAP法抗氧化能力

0. 234 ±0. 008c 0. 273 ±0.006? 65.765 ±1. 165 B DPPH自由基淸除率/%

66,353 ±0.499e 68. 353 ±0.665c

2.4生物活性追踪法丁香抗氧化活性的研究

在发现丁香粗提物具有较强抗氧化活性的基础 上，采用生物活性追踪法对丁香抗氧化物质进行活 性追踪，以便了解丁香抗氧化活性物质来自于哪个 极性部分。以相同质量浓度的BHT和VC为阳性 对照，对采用1.3.4节方法获得的丁香3个不同极 性部分（乙酸乙酯相、正丁醇相和水相）分别进行抗 氧化活性（总还原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH 自由基清除能力）测试，通过不同极性部分抗氧化 能力的强弱得到活性追踪的结果。

不同极性部分总还原力测定结果表明（表6)， 丁香抗氧化活性物质主要存在于弱极性的乙酸乙酯 部分，其700 rnn的吸光度高达0.634 ±0.040,显著 性高于其他两个极性更强的正丁醇相（0.066 ± 0.009)和水相部分（0? 142 ±0.005) (P <0.001)。 同时，乙酸乙酯相的总还原力也高于阳性对照BHT (P <0. 001)，尽管稍低于 VC(0. 695 ±0. 043)，但无 显著性差异（P>〇.〇〇l)。由此可见丁香乙酸乙酯 相具有极强的抗氧化能力，丁香的抗氧化物质主要 来自于该相。丁香不同极性部分FRAP法抗氧化能 力结果表明（表6)，在丁香不同极性部分的样品中 仍以乙酸乙酯相抗氧化活性最髙，其在593 nm处的 0D值高达0.433 ±0.005,均极显著性高于正丁醇 相

（0. 117 ±0.018)和水相（0? 192 ±0.011) (P < 0.001)，同时也显著性高于阳性对照BHT(P < 0.001),虽然稍低于VC，但无显著性差异（P > 0.001)。由此可见，丁香的强抗氧化活性物质主要 来自于乙酸乙酯相得到了进一步验证。

丁香不同极性部分DPPH自由基清除率结果表 明（表6)。在3个不同极性部分中仍以乙酸乙酯相 清除率最高（85. 294 ±0.499)% ,极显著性高于正 丁醇相（64_ 941 ± 0. 666 )% 和水相（22. 000 ± 2. 163)% (/><0. 001)，尽管乙酸乙酯相清除率低于 VC ( 94. 706 ± 1. 165 )%，但仍显著性高于BHT (68.353 ±0.499)% (尸 <0.001)。由此可见，丁香 极强的自由基清除能力的物质基础也主要是由弱极 性的乙酸乙酯相所贡献。Jiang等[1]和〇1如等[18] 在采用类似的生物活性追踪法研究香椿和紫莉花强 抗氧化活性物质时也发现这两种植物的抗氧化活性 物质主要来自于弱极性的乙酸乙酯相。

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第1期 江慎华等：丁香活性物质提取工艺优化与抗氧化活性研究 137 表6丁 脅不同极性部分抗氧化能力的测定结果 Tab. 6 Antioxidant activities of the different fractions from clove 抗氧化活性 总还原力 FRAP法抗氧化能力 DPPH自由基清除率/% 样品（100 jxg/mL) 水相 乙酸乙酯相 c 正丁醉相 0.066 ±0.009 cBHT AVC 0. 142 ±0. 005 0. 192 ±0.011? 22.000 ±2. 163D 0.117 ±0.018° 64. 941 ±0. 666c A0.433 ± 0.005 85.294 ±0. 499? 0,634 士 0.0400.518 ± 0.006B 0,695 ±0.043 A 0.472±0. 023 A 94. 706 ±1. 165A 0. 234 ±0.008? 68. 353 ±0.499c 注：同一行不同宇母表示各样品之间存在显著性差异（P <〇. 〇〇1)。 2. S 丁香抗氣化活性物质基础的初步分析

为了进一步分析丁香强抗氧化活性的物质基 础，对丁香各不同极性部分的总黄酮和总多酚的含 量进行了测定，其测定结果如表7所示。从该表可 见，丁香乙酸乙酯部分的总多酚与总黄酮含量最高， 分别达到（522_ 690 ± 9_ 415 ) mg/g 和（258. 586 ± 30. 168)mg/g，均显著性高于其他两个极性部分 (/><0? 05)。不同极性部分总多酚和总黄酮含量与 总还原力、FRAP法抗氧化能力极度相关，与DPPH 自由基清除能力也高度相关，其^分别为〇. 994 1、 0? 975 3、0. 762 8 和 0. 987 8、0. 963 7、0? 790 9。由此 可见，丁香抗氧化活性的主要物质来源于乙酸乙酯 部分，而乙酸乙酯部分强抗氧

化活性的主要物质基 础由该部分高含量的总多酚和总黄酮所贡献。Jiang 等~采用类似的方法对香椿抗氧化活性进行研究 时也发现其主要的抗氧化活性物质也存在于乙酸乙 酯部分，主要的物质基础也是由高含量的总黄酮和 总多酚所贡献，其不同极性部分FRAP法抗氧化能 力和总还原力与总多酚和总黄酮含量的相关系数分 别为 0.979 6、0? 980 0 和 0.976 8、0. 982 4。由于绝 大多数黄酮类化合物的天然存在形式为糖苷型，而 黄酮苷元的抗氧化能力基本都比相应的糖苷类化合 物强[19~M1。因此，采用相应的酸或酶对丁香乙酸乙 酯部分水解将黄酮苷转变成相应苷元的话会进一步 提高其抗氧化活性。

表7 丁番不同极性部分总多酚、总黄_含置及抗氣化活性与其相关关系 Tab. 7 Contents of the total phenols and flavonoids and

the correlation between the reducibility and the antioxidant activity of clove 成分含M：/mg*g_l 乙酸乙酯相 正r醇相 5. 870 ±1.058c 53. 283 ± 13. 080? 成分含量与抗氧化活性之间的相关关系 水相 18. 1 ±0. 230 9* 50. 168 ±10, 895\ 总还原力 R2 =0. 994 1 R2 =0.987 8 FRAP法抗氧化能力 R2 = 0. 975 3 R2 =0.963 7 DPPH自由基清除能力 R2 =0. 762 8 R2 =0. 790 9 总多酚 522. 690 ±9. 415* 总黄圈 258. 586 ± 30. 168A 注:同一行不同字母表示各样品之间存在显著性差异（P <〇.〇5)。

3结论

(1) 通过单因素试验和正交试验确定了丁香抗 氧化活性物质的最佳提取工艺，在此条件下获得的 丁香粗提物具有较强的抗氧化活性。

(2) 通过生物活性追踪发现丁香抗氧化活性物 质主要存在于其弱极性的乙酸乙酯部分，该部分质 量浓度

为1〇〇 jig/mL样液的总还原力、FRAP法抗 氧化能力和DPPH自由基清除率均显著性高于阳性 对照 BHT(P <0.001)。

(3) 相关关系表明丁香抗氧化活性的主要物质 基础为其髙含量的总多酚和总黄酮。

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