实验三 植物染色体标本制备与观察

实验三 植物染色体标本制备与观察 孚尔根反应（Feulgen Reaction）

一、实 验 目 的

1. 熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法 2. 掌握植物染色体标本的制备技术

二、实 验 原 理

Feulgen反应(Feulgen reaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。自Feulgen反应法问世以来，其作用机制也久经研究和讨论，目前认为其具体反应原理是：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说，DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。其反应机制如下所示。 2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3

三、实 验 用 品 （一）、器材：显微镜、水浴锅、烧杯、镊子、刀片、载玻片、盖玻片 （二）、材料：小麦根尖。 （三）、试剂： 1. schiff氏试剂：

将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳，摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。

2. 亚硫酸水(漂洗液) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。

3. 1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。 4. Carnoy固定液：甲醇3份，冰醋酸1份。

四、实 验 方 法

将小麦种子置于28℃发芽，待根长到1-2cm后取出，冰水处理24h ↓

将根尖投入Carnoy液中固定24h，转入70%酒精保存（固定） ↓

用水浸洗2次，每次3min ↓

将根尖投入加有预热至58-60℃的1mol/L HCl的小烧杯中，水解10-15分钟（水解） ↓

弃去HCl，用水浸洗2次，每次3min ↓

吸去水分，加入Schiff试剂，染色20-30min （染色） ↓

弃去Schiff试剂，用漂洗液换洗2-3次（漂洗） ↓

取出根尖，仅切取3-5mm左右长度的根尖部分放于载片上，滴加醋酸溶液，压片

↓

轻敲盖片，使根尖充分压开分散，镜检观察

五、作 业

1. 选取视野中一至两个正处于有丝分裂时期的细胞，绘图表示Feulgen反应的染色结果，并标明是处于哪个时期。 2. 分析本实验的观察效果如何，如效果尚有待提高，请分析造成染色体标本制做不佳的原因有哪些。

思 考 题

1. Feulgen反应的实验原理是什么？

答：DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。

2. 在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？ 答：亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用schiff剂染色时所残留的碱性品红反应掉，以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。

在显微镜下，染色体被染成紫红色，胞浆完全不着色。对于分散好的染色体, 其间相互散开, 短臂收缩适中, 二条姐妹染色单体大致平行分离, 着丝粒清晰可见。

1. 通过对自己制做的染色体标本观察，总结小麦根尖染色体的形态特征。 2. 对于分散好的染色体，可进行染色体计数。

Feulgen方法应注意的几个问题： 1. 对照切片的制做

进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。 2. 固定剂的选择 以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。 但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。 3. 水解时间

Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。 4. Schiff试剂的作用

Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。