达安 HBV-DNA定量试剂说明书

HBV-DNA PCR检测规程

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是不易做到的。灵敏度提高得益于光谱技术。 2.4 荧光探针杂交，进一步提高了特异性

PCR 扩增中常会出现非特异性扩增和引物二聚体，从而影响了对特异电泳带的判断。FQ-PCR通过特异性探针杂交信号检测PCR扩增产物，相当于PCR反应过程中自动完成了Southern杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。

2.5 扩增与自动分析一体化，检测更加简便和快速

FQ-PCR通过计算机和分析软件，使PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，比传统定性PCR更为简便和快速，同时也避免了传统PCR产物分析中有害物质对人体的影响，计算和数据处理也有利于科研和临床资料的保存和分析。 3. 临床应用概要

科学研究已经证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关，临床实验医学正进入基因诊断时代。但对于许多疾病的发生和发展来说，相关基因不是有无问题，而是一个从量变到质变的过程，基因定量检测更具有临床意义。 3.1 感染性疾病

PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~102基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

定量PCR研究资料已表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。许多研究表明，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关；有也研究表明，HIV病毒载量低于一定值时，没有传染性。

在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感；而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作 用。 3.2 肿瘤

尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚，但相关的基因的遗传学改变的积累，是致癌性转变的根本原因已被普遍接受。

癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。 几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。

肿瘤标记物质也是肿瘤诊断的热门研究领域。目前临床对此多用免疫学方法检测，灵敏度低，一般需要达到108个分子数。用定量逆转录(RT)-PCR方法，一般条件下可检出10-102某种标志物的mRNA，可大大提高检出率。

一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访。 3.3 遗传病

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PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。

总之，除与疾病直接相关的基因检测外，各种与疾病相关的细胞因子、激素、受体，用FQ-PCR方法检测其基因表达水平具有更高的灵敏性，更有利于疾病诊断。 参考文献

[1] Liva K J, Flood SJA, Marmaro J, et al. Oligonucletides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched prode system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Applic, 1995,4:357-362.

[2] Holland PM, Abramson RD, Waston R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5′to 3′exonuclease activity of the

themus aquaticus DNA polymerase. Proc Nat Aca Sci USA,1991,88:7276-7280 [3] Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, et al. Stimutaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology, 1992, 10:413-417. 一 荧光探针定量PCR定量检测的意义

定量检测与定性检测的最大区别就在于，定性只是检测病原体核酸的“有”或“无”，而定量可以检测病原体核酸量的“多”或“少”。 定量检测的意义：

1. 2. 3. 4. 5. 6.

体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。 评价和考核治疗效果。

用于传染病发病的监控、预测与预防。 作为新的愈后指标。

建立新的病原体分子诊断标准。 新的药物及疗法的研究与开发。

二 荧光定量PCR报告结果的读取：

荧光定量PCR是直接扩增病原体的特异性DNA或cDNA，其结果反映了标本中DNA或RNA存在的多少，结果通常用数字表示，

报告为“copies/ml”、“2U/ml”或“copies”, copy即“拷贝”，表示病原体基因组的个数，该数据越大，表明病原体在体内复制得越厉害，传染性越强。

例：HBV-DNA 定量结果报告：3.637×104 IU/ml（如果采用科学记数法表示为：3.637E+04），代表每ml血液中含有36,370国际单位乙肝病毒分子。

如果待检标本能够定量，如血液等，结果报告为多少copies/ml或2U/ml。 如果待检标本不易定量，如分泌物、痰液等，结果只报告为多少copies。 乙型肝炎病毒（HBV）

一 乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染

HBV感染是全球性公共卫生问题，世界卫生组织统计，全世界乙肝病毒携带者有3.5亿人之多。我国人群HBV携带率约为10%，有近1.3亿人感染HBV，是世界上最大的“肝炎大国”。

HBV感染后临床表现呈多样性，可表现为重症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者，其中部分慢性

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肝炎可演变成肝硬化或肝癌。HBV携带者因无症状，不易被察觉，其作为传染源的危害性比患者更甚。 HBV病毒颗粒呈球形，具有双层的衣壳，HBsAg镶嵌于脂质双层的外衣壳中。HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要标志，可刺激机体产生保护性抗体即HBsAb。

HBcAg位于内衣壳部分，其外被HBsAg所覆盖，不易在血循环中检出。其抗原性较强，能刺激机体产生HBcAb。HBcAb lgG在血中持续时间较长，为非保护性抗体。HBcAb lgM提示HBV处于复制状态。 HBeAg是Pre C基因（前核基因）的编码产物，是一种非结构性蛋白，为可溶性蛋白质，自肝细胞分泌入血中。HBeAg的消长与病毒体的DNA聚合酶的消长一致，故可作为HBV复制及强感染性的指标。其刺激机体产生HBeAb，对HBV感染有一定的保护作用，通常认为HbeAb的出现是预后良好的征象。 在这三对抗原、抗体系统中，核心抗原较难检测到，一般不作为临床常规检查，故称为“两对半”。其中HBsAg、HBeAg、HBcAb三项阳性称为“大三阳”， HBsAg、HBeAb、HBcAb三项阳性称为“小三阳”。

二 “两对半”检测与HBV-DNA定量

“两对半”是从免疫学水平来检测HBV感染机体后引起免疫应答，产生相应抗原抗体的含量（这个“含量”还不是定量，而只是抗原抗体的“有”或“无”），它实际上测定的是机体感染HBV后免疫应答结果的反映。由于个体反应的差异，不同的人在感染HBV后会出现不同的免疫应答，从而得到不同的“两对半”结果模式。如产生抗体、表现为“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等等。但是所有这些免疫学指标不能反映患者或病人体内病毒的复复水平及传染程度，不能提示其与乙型肝炎的发生和发展过程之间的联系。

荧光探针定量PCR技术则是从分子生物学水平直接检测HBV病毒自身的遗传物质DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。

HBsAg虽然是HBV的感染标志，但在感染的早期，或由于S基因（编码HBsAg）的低水平表达或变异，常规方法难以检出，会导致漏检。HBV-DNA检测比免疫学检测更早期、更灵敏。免疫学方法检测为HBsAg(—)的病人中，约有3%以上检测出HBV-DNA(+),健康供血者用PCR方法检测HBV-DNA，也有一定比例的阳性。HBsAg阴性的慢性肝炎中，仍有部分是HBV感染引起的。所以单凭HBsAg阳性与否来判断肝脏中HBV的复制及有无传染性是远远不够的，易造成部分慢性型病毒性肝炎的漏诊。对于HBsAg阴性或有HBV感染后的任何血清学依据都应进一步进行HBV-DNA荧光定量检测。也有时出现HBeAg(—)而HBV-DNA(+)的结果，这是因为编码e抗原的Pre C区基因极易出现变异，在Pre C区出现终止密码子，使Pre C区基因与C区基因不能转译出完整的e抗原，导致HBeAg表达缺失，机体感染HBV不表达HBeAg，当然血清学方法也不能检测出HBeAg的存在。

HBsAg(+)患者中大约有1-10%检测不出HBV-DNA，这种情况在世界各国都有报道。一方面，由于HBV-DNA整合于宿主细胞基因组，或基因变异，与常用的PCR引物、探针不匹配，PCR扩增不出相应的基因序列，因而未能检出。此外，由于HBV的复制有反转录过程，S基因（编码表面抗原）可以以2.1Kb RNA为mRNA转译成HBsAg，故在部分HBV感染中虽无病毒复制，但可长期产生HbsAg。5～10% HBV感染者表现为单项HBcAb阳性。有许多报道证明，单项HBcAb阳性的血液可以引起HBV的输血后感染。如果同时检查HBV-DNA，可以减少漏检，预防输血后肝炎的发生。

应用PCR检测发现，大多数“大三阳”病人血中能够检出HBV-DAN（检出率约为96%左右），有相当一部分人e抗原转化e抗体后，即“大三阳”转化为“小三阳”后，其血清中仍有DNA存在(检出率约为30%)，说明病毒仍未消失和停止复制。“小三阳”病人血清中HBV-DNA转阴率约为60-70%，这与病毒遗

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传物质突变或与宿主基因组整合、用药后复制暂停、以及血清HBV病毒炎症清除使血清中的HBV-DNA消失或下降至极低浓度（低于检测下限）有关，这种情况下并不表示病人恢复，应随访并复查血清HBV-DNA以免误症。

要特别指出的是，近年来由于抑制病毒复制的核苷类药物药物（如拉咪呋啶）在临床的大量使用，使得HBV-DNA复制水平可能会在短时期内迅速降低至不可检测水平（这时候免疫学检测指标可不发生改变），但是随着患者出现药物耐受或产生基因突变，HBV-DNA复制水平又可能呈现一种上升趋势，从而使HBV-DNA定量检测出现相对复杂的动态变化结果。 三 荧光探针PCR定量检测HBV-DNA的意义

（一）HBV-DNA定量检测，临床上以＜103 copies/ml为检测临界值，可作为乙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标。慢性乙肝患者血清中HBV-DNA＞105 copies/ml的患者，如果体内丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平异常，应考虑接受抗病治疗。

（二）HBV-DNA定量检测是直接对HBV的遗传物质DNA进行基因扩增，是病毒复制和存在的最早期、最灵敏也是最可靠的指标，可对HBV感染作出早期诊断。乙肝病人传染性与其血清中HBV-DNA含量高低呈正相关，病人血清中HBV-DNA复制水平越高，其传染性越强。

（三）乙肝的治疗目前尚无特效方法，常用的有干扰素和拉咪呋啶。临床上一般认为用药后HBV-DNA下降到105 copies/ml以下为对药物完全应答；定量下降大于2个数量级(102)为对药物部分应

答；未达上述标准为低应答或无应答。研究表明，对于干扰素治疗：(1)治疗前HBV低水平复制者对 干扰素的反应性明显优于高水平复制者。HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV-DNA含量较低者，而治疗前HBV-DNA含量特别高者大多疗效不佳；(2)治疗中病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治疗期间HBV-DNA水平下降较慢，或下降幅度较小，或变化不明显者，大多治疗无效；(3)治疗结束后，采用PCR定量法监测，HBV-DNA完全转阴一年以上者，可能不再复发，而终止治疗后HBV-DNA仍保持较低水平者，反跳的可能性较大。核苷类药物拉咪呋啶有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV基因突变，患者易产生耐受性，且易出现停药后反弹。

（四）肝移植前患者血清HBV-DNA水平的高低决定移植后肝脏是否再感染HBV。因为HBV主要侵犯肝脏，建议移植前使用抗HBV药物，最大限度降低血清HBV-DNA浓度，有助于防止HBV侵犯移植后肝脏，提高肝脏移植的效果。

（五）乙肝妇女怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机，要选择低病毒载量时受孕。乙肝孕妇怀孕期间定期进行定量PCR检查，有助于使部分病人得到及时、正确的诊断，减少宫内感染的风险；母—婴传播多发生于胎儿期和围生期。尤其是HBsAg和HBeAg双阳性的母亲，体内HBV-DNA复制水平相对较高，发生胎内传播和围生期感染的机率均较高。因HBV可通过乳汁直接传染给婴儿，哺乳期妇女，除血液检测外，还应进行乳汁HBV-DNA检测，以决定是否母乳喂养。

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 批准文号：

国食药监械(准)字2012第3400078号 用 途：

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文件编号：SZGL-C005-00 版本：00 修订次数：00 末次修（制）订日期：20030822 本试剂盒应用荧光定量PCR的技术体外定量检测人血清或...[查看说明书] 规 格：

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