肺结核的医学诊断

2)L型结核分枝杆菌可在结核患者各种标本中检出。L型结核分枝杆菌的检查对诊断菌阴结核病有极其重要意义。临床上，细菌L型的主要意义在于细菌仍有致病性，而且是临床上感染漏诊的主要原因之一。 (5)方法学评价及同题

1)细胞壁染色法有其缺陷，其只能证明标本内存在L型菌，但不一定就是L型结核菌，培养法还须经返祖才可确诊为L型结核菌，其费时太长。如能在做细胞壁染色及培养的同时，结合分子生物学方法来确诊是否为L型结核菌，将大大提高确诊的效率，而且会使L型结核分枝杆菌检测更加快速，符合临床需要。

2)细菌L型需在高渗和营养丰富的条件下才能生长，细菌L型生长缓慢，无阳性发现可报告无L型细菌生长。

3)细菌L型对抗生素的敏感性往往与原菌有所不同。 4.结核杆菌耐药基因的检测

(1)测定方法：直接测序法，单链构象多态性分析(SS-CP)及固相杂交法。 (2)标本：痰液。 (3)参考范围：阴性。 (4)临床诊断价值和评价

1)抗结核药物的应用，使得结核病得到控制和治愈，然而间断用药、不合理的用药、管理不善等致使结核分枝杆菌不能及时被药物杀灭而产生耐药性。耐药结核病导致病程延长，死亡的危险性增加，传染性增加，已成为引起全球结核病急剧上升的原因之一，特别是耐多药结核病(mdr-th)的发生对结核病控制规划的实施构成严重的威胁。耐多药结核病是指至少对抗结核药物中异烟肼和利福平产生耐药的结核病。耐药性是通过结核分枝杆菌特有细胞壁降低多数药物通透性、结核分枝杆菌产生诸如β-内酰胺酶的降解酶类和其他药物修饰酶两种途径产生的。通过基因的分析，染色体突变介导的耐药性是结核分枝杆菌产生耐药的主要形式，由于靶基因核苷酸的突变，形成错误的氨基酸顺序，影响了药物和靶位酶的亲和性，形成结核分枝杆菌对药物的敏感性下降或耐受。由于基因突变的发生.有2／3以上的结核分枝杆菌菌株对多种抗结核药物产生耐药性。快速鉴定结核分枝杆菌耐药基因类型，了解结核病患者的耐药状况，对指导临床的化疗和防止耐药菌株的播散是非常必要的。

因为检测患者结核的耐药谱是治疗的必要条件，但普通的培养加药敏试验需

要时间可达2个月，时间长，早期得到耐药信息对患者的治疗更有意义。临床标本经前处理后接种在改良罗氏固体培养基或改良罗氏的液体培养基进行直接(绝对浓度法)或间接(比例法)的药敏试验。这是传统的方法，也是应用最早、最为普遍的检测结核分枝杆菌耐药性的方法，也是判定其他检测方法时的参考标准［13］。该方法操作简单、经济、适用于经济欠发达地区使用，但是存在着检测周期长(6～8周)、阳性检出率低、不易标准化、结果重复性不佳、费时费力等缺点，不能满足临床的急需。 2)近年来研究证实：①耐利福平主要是由于编码RNA聚合酶的rpob基因突变；②耐异烟肼系与katg、inha／maba、ahpc基因突变有关；③pcna基因突变是耐毗嗪酰胺酶药的主要原因；④编码16srRNA的rrs基因和编码s12蛋白的rps1基因的突变与耐链霉素有关；⑤乙胺丁醇耐药株与embab基因有关。耐多药是由于多种药物靶基因突变所致，少数耐多药分离株只有一个利福平耐药基因突变.可能只存在一个突变位点，也可能系检查技术所限，未能测出所有突变。

(5)方法学评价及问题 1)直接测序法：是鉴定突变的金标准.利用耐药区域PCR扩增，PCR扩增产物纯化或克隆化取DNA片段直接测序，与标准敏感菌株的同一DNA片段比较，分析碱基突

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变的位置和分布。目前已应用自动化DNA测序仪分析临床分离的结核杆菌基因突变。 第三代DNA测序技术通过现代光学，高分子，纳米技术等手段来区分碱基信

号差异的原理，可以直接读取序列信息。DNA序列分析法是一种直接、客观的检测突变的方法，但由于设备和技术条件限制了其广泛应用。

该方法不仅能用于细菌基因突变的检测，而且能够确定其突变的部位与性质，是检测基因突变的决定性方法。PCRDNA序列测定简便、快速，约8～48 h即可完成，是最常用的测定方法。目前，DNA序列测定已作为从基因水平进行结核分枝杆菌耐药性测定的金标准。但对每一菌株来说，要测定各种抗结核药物的所有已知突变部位，需多次反应，同时费用昂贵，因此其应用受到限制。故此法多作为评价其他方法的参考方法，或与其他方法结合应用。

2)聚舍酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)：PCR-SSCP原理是单链核酸通过自身互补或分子内的相互作用形成折叠构象，单个核苷酸的突变可造成其构象改变，从而导致其在非变性凝胶电泳上迁移速度的改变，是检测单碱基置换和碱基缺失或插入的可靠而简便方法.比直接DNA测序容易进行，可作为检测的快速筛选方法，也是一种检测耐药性的有效手段。目前用荧光素标记PCR扩增产物而建立自动化SSCP分析法，可直接检测痰涂片阳性标本和Bactec阳性培养物中的耐药菌株，适用于大量标本的快速筛选。

3)固相杂交法：根据结核分枝杆菌RFP耐药ropb基因突变资料，设计一组覆盖69bpropb高变区的寡核苷酸探针，包括结核分枝杆菌探针一个，覆盖69bpropb高度区的野生型探针5个，ropb突变特异的撵针4个。依次固定于尼龙膜上，然后与待测菌株ropb基因扩增片段进行杂交，根据杂交谱带判断有无突变及突变的类型。因采用多个撩针且固定于尼龙膜上形成多列，此方法又称为多列探针检测法(lineprobeassay，LiPA)。该方法可快速鉴定结核杆菌RFP耐药株ropb基因的突变，适合于临床标本的直接检测。现已有商品化LiPA试剂盒。

4)反向线性点杂交技术：用膜芯片检测结核分支杆菌对链霉素和乙胺丁醇的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，可作为常规药敏方法的补充，用于指导开展早期，

有效的临床化疗。检测速度快，数小时到一天时间就可以完成检测。缺点是受探针数量限制，与测序技术相比，反向斑点杂交技术就不能检测到所有可能的突变类型，也更不可能检测到新的突变类型；另外基因突变和耐药表型也并非是一一对应的关系；所以反向杂交技术只能作为快速检验的辅助手段，下一步将进一步扩大探针系列中的探针数量，更多检测结核耐药性位点。

5. T淋巴细胞亚群(CD4+细胞／CD8+细胞)目前T淋巴细胞较为明确的两个亚群是辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)。辅助性T细胞是能够帮助B细胞分化成抗体产生细胞和放大细胞免疫应答的一个细胞群，表达CD4但不表达CD8。细胞毒性T细胞(Te)是能特异性溶解靶细胞的一个细胞亚群，表达CD8但不表达CD4。CD4分子可增强对MHCⅡ类抗原的结合，CD8分子增强对MHCⅠ类抗原的结合。临床检测CD4+细胞／CD8+细胞可作为细胞免疫功能的评价指标之一。

(1)测定方法：流式细胞仪测定、荧光免疫组化技术、酶免疫组化技术等。其原理是利用CD系统的单克隆抗体(MeAb)与外周血单个核细胞反应的百分率，可确定人T细胞亚群的分布情况。

(2)标本：肝素抗凝血。

(3)参考范围：CD4细胞阳性率为(45.7土5.3)％；CD8细胞阳性率为(27.9±5.0)％；CD4+／CD8+细胞比值为1.66±0.33。

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(4)临床诊断价值和评价：T淋巴细胞介导的细胞免疫是人体对结核分枝杆菌主要免疫保护机制。CD4和CD8细胞是结核病产生保护性免疫反应的主要效应细胞。在结核分枝杆菌感染的早期，活化的CD4和CD8细胞就向感染病灶转移和聚集，通过递呈抗原、参与结核结节的形成、溶解被感染的细胞以及直接杀菌等作用来控制结核分枝杆菌扩散和防止结核病灶的复燃。肺结核尤其是活动性肺结核，其外周血中的CD4+细胞百分率增加，CD8+细胞百分率减少，CD4+／CD8+细胞比值增加明显。 (5)方法学评价及问题

1)流式细胞仪(flowcytometer，FCM)是利用流式细胞技术对细胞或颗粒进行快速分析的自动分析仪。近年用流式细胞仪测定T细胞亚群日益广泛，结果稳定，重复性好。

2)荧光免疫组化技术、酶免疫组化技术等主要影响是荧光抗体应有较高纯度，否则易出现假阳性结果。试验中所用McAb和荧光抗体的最适工作浓度均应通过预试验选择。

3)婴幼儿CD4+细胞数较高而CD8+细胞数较低，老年人CD8+细胞数下降，因而其CD4+／CD8+细胞比值较高；男女性T细胞数及其亚群相似.但女性CD4+／CD8+细胞比值高于男性。在分析结果时应对此加以考虑。

6. 分枝杆菌菌种鉴定基因芯片

我国分枝杆菌感染11.1％是NTM（非结合分枝杆菌）。结核和NTM有相似的临床表现，但对于不同药物敏感性不同。所以关于NTM准确诊断的必要性是有必要的。 传统菌种鉴定方法根据菌株生长速度，色素产生，光反应，生化反应等进行分群，烦琐费时，不利于指导临床诊断。反向斑点杂交法快速鉴定分枝杆菌菌种，旨在建立一种新的简便，快速，特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。基因芯片检测系统，可快速、准确检测临床样本中的分枝杆菌的菌种类型，具有检测周期短(整个过程只需1天)、灵敏度高、特异性强的优点，对于指导临床用药和治疗有重要的意义，可广泛用于临床分枝杆菌菌种鉴定试验。涉及用于分枝杆菌菌种鉴定的基因芯片检测系统，包括用于检测分枝杆菌属、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和偶发分枝杆菌的基因芯片和待测样品中以上菌种的16SrRNA和23SrRNA之间的插入序列(ITS)基因的PCR引物。 (1)测定方法：利用rpoB基因芯片技术快速进行分枝杆菌菌种鉴定。以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因。用基因芯片技术检测21种分枝杆菌标准株；8种其它细菌标准株；126株临床分离株。分枝杆菌与其它细菌标准株经PCR扩增后，分枝杆菌标准株均扩增出360bpDNA片段，在其它细菌中，除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外，其它细菌均未见扩增。21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交外，其余均为特异性杂交。对126株临床分离株进行鉴定，89株为结核分枝杆菌，占70．6％（89／126），非结核分枝杆菌（NTM）占9．2％（9／98）。应用rpoB基因芯片技术鉴定分枝杆菌菌种，是一种快速、准确的方法，具有较高的临床应用价值。

(2)标本：分离株或痰样本 (3)参考范围：鉴定临床常见的结核分枝杆菌复合群及22种致病性非结核分枝杆菌。 (4) 临床诊断价值和评价：

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(5)方法学评价及问题：利用膜芯片技术建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法。方法：以DNA直接测序法为对照，通过PCR．SSCP和膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和199株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果：应用膜芯片技术分析11种分枝杆菌标准菌株和7种非分枝杆菌菌株，特异性100％。199株分枝杆菌临床分离株中，经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定，30株为结核分枝杆菌复合群，应用膜芯片分析，显示与分枝杆菌属探针分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性，两种鉴定方法结果一致：169株PCR．SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株，经芯片分析，58株为龟分枝杆菌，46株为胞内分枝杆菌，33株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群，6株为偶然分枝杆菌，15株为戈登分枝杆菌，3株为乌分枝杆菌，2株为海和溃疡分枝杆菌复合群，另6株只与探针分枝杆菌杂交，经测序显示2株为胞内分枝杆菌，但其基因序列与标准菌株不完全相同，1株为土分枝杆菌，1株为迪氏分枝杆菌，1株为草分枝杆菌，1株为新金色分枝杆菌，芯片上无鉴定该菌种的探针。结论：应用膜芯片技术可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种，指导临床合理治疗。

【应用建议】

临床上一旦怀疑肺结核就应进行反复多次痰液涂片找结核分枝杆菌，以及痰液细菌培养和药敏试验，以检到结核分枝杆菌为诊断依据，及早确定治疗方案，控制疾病的传播。如果未检到结核分枝杆菌，对高度疑似患者应进行结核特异性抗体、L型结核分枝杆菌检查、结核分枝杆菌分子生物学等检测，尽快给临床的诊断提供有效的实验室依据。在肺结核的治疗过程中，要及时了解机体各系统的状况、疾病的程度以及药效，需间断性检测血常规、血沉、肝肾功能、免疫功能等，对疗效不明显的有必要进行结核分枝杆苗耐药基因的检测，以有助于肺结核的诊断、治疗及疗效监测。

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