动物细胞工程简化版

原代培养（primary culture） 从机体取得材料（细胞、组织或器官）在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养或初代培养。

传代培养或传代（passage） 指将细胞从一个培养容器移植到另一培养容器中培养。 3、原代培养

体外培养细胞从细胞接种到分离在培养，一般要经过以下几个阶段。

游离期 细胞接种后，在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

贴壁期 细胞附着于支持物上，游离期结束。原代细胞大多数在24小时内贴壁，细胞株平均在5～30分钟贴壁。单个细胞贴壁快，细胞团和组织块贴壁慢。培养基偏酸偏碱，细胞机能不良或濒死细胞都不易贴壁。另外，培养基污染、胶塞有毒、培养器材不洁等都不利于细胞贴壁。

生长基质是带正电荷的糖蛋白，细胞表面唾液酸残基带有负电荷，因静电吸引作用使细胞容易贴附。血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白（CIC）和纤粘素（FN）等，均属于糖蛋白。实验证实：CIG具有使细胞贴壁生长和促胞质分裂的作用。1～5微克/毫升的FN能促进细胞贴壁，含10％小牛血清的全培养基中有2～3微克/毫升的FN。FN与细胞表面FN受体结合，引起细胞骨架重组，促进细胞粘着、铺展、增殖。某些动物细胞如人的成纤维细胞，能合成大量纤粘素，因此即使在无血清的情况下也能贴壁。相反，某些细胞如许多分化程度高的细胞或转化细胞，合成这种糖蛋白量很少，只有在培养基中补加血清或外加带正电荷的糖蛋白，如鱼精蛋白或生长在多聚赖氨酸覆盖的培养皿中，才能改善细胞贴壁率和克隆生长率。CIG与多聚赖氨酸联用，也能使细胞迅速贴壁。

细胞贴壁后由圆形细胞变成放射延展细胞，进而过渡成极性细胞。放射延展细胞的中央为胞核，核周围胞质较稠密（即内质），含有较多的细胞器，主要是颗粒状或线状的线粒体。细胞质的外质部分无色透明，内含有较少的细胞器如微丝、微管，需特殊染色显色。放射延展细胞持续0.5～2小时，过渡为极性细胞（即细胞的分化形态）。极性细胞常见的有成纤维细胞型和上皮细胞型。极性细胞形态常随细胞运动发生改变，成纤维细胞的外质周边部可分为活跃与不活跃的两部分，不活跃部分比较稳定，活跃部分常伸出伪足，使细胞发生定向运动。有的细胞附着于支持物后，也可不经过放射延展阶段直接变为极性细胞。上皮细胞稍有不同，它们经过延展阶段进入极性细胞时，细胞相互接壤成片，似无极性，外质周边也无明显活跃与不活跃部分的区别。

潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。原代培养细胞潜伏期长，一般为24～96小时或更长。细胞株潜伏期短，一般为6～24小时。潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，标志细胞进入指数生长期。

指数生长期（又称对数生长期） 此时期细胞增殖旺盛，细胞数成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

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此阶段可以用细胞群体倍增时间、细胞分裂指数、H-TdR渗入法等来判断。在细胞接种数量适宜的情况下，培养3～5天后，细胞数量增多。成纤维细胞膜呈现特征性的皱褶样活动，当两个细胞相互接触时，其中一个或两个停止移动，并相互远离。当一个细胞被其它细胞固定无处可去时就停止移动，接触区域的细胞膜皱褶样活动便会停止。这样保证了细胞不重叠生长，此现象称为接触抑制（contact inhibition）。转化细胞或癌细胞失去接触抑制特征，导致癌细胞相互重叠向三维空间发展，只要营养充分，细胞仍然能够进行分裂，细胞数量持续增多。正常细胞生长汇合成单层时，细胞达到一定密度，细胞停止分裂，这种现象叫密度抑制（density inhibition）。这时细胞可维持存活一段时间，但不发生分裂增殖细胞生长所能达到的饱和密度，因细胞的类型而不同，也因培养条件的改变而改变。特别是转化细胞和癌细胞的密度抑制调节下降，因此可以生长分裂至较高的细胞密度。

细胞从贴壁期、潜伏期进入增殖期，其表面亚微结构发生相应变化：细胞贴附后，伸长成其固定有分化形态，如上皮型细胞扁平，呈不规则多边形；成纤维型细胞伸长成梭形、不规则三角形等。部分细胞紧贴在培养瓶壁，从G0期进入G1期，从G1期进入S期，核内DNA合成，细胞表面微绒毛和小泡很少。细胞进入G2期，特别是G2期的中期，细胞渐渐从贴壁的摊平状态鼓起来，细胞表面的微绒毛增多。细胞进入有丝分裂期（M期），细胞进一步变成球状，微绒毛更多了。M期的末期，分裂成两个子细胞，细胞仍保持圆球状。子细胞进入G1期又从圆球状变得扁平，表面突起消失和微绒毛减少，表面铺开拉平，贴在培养皿的壁上。细胞表面的周期性变化，反映细胞内部剧烈的生命活动和环境物质交换的变化。

停止期（平顶期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂增殖，可继续存活一段时间。为保存细胞活力，通常在细胞长满瓶底80％时传代，即将细胞接种到2～3个新瓶皿中，继续培养繁殖。若不及时传代，由于营养物质的消耗和代谢物的积累，细胞发生中毒性改变，甚至脱落死亡。传代过晚（已有中毒迹象）可影响下一代细胞的机能状态。要恢复至正常状态，还要再传一两代，待不健康的细胞被淘汰掉后，方可做实验。

小鼠和人成纤维细胞在培养条件合适情况下，细胞单层形成后，仍可继续增殖，呈重叠复层生长特征。 4、细胞周期

细胞每一次增殖所经历的全过程称为细胞的增殖周期，简称细胞周期（cell cycle）。从理论上说，细胞每经过一个增殖周期，在数量就增加一倍。根据细胞周期不同时期的生化特点，可以把一次细胞周期划分为四个连续的时期

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或时相（phase），即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞周期的各时相应循着G1-S-G2-M?G1的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程，主要为遗传物质DNA的复制。有丝分裂期（M期）完成遗传物质（染色体）的分配。细胞群中多数细胞处于间期，少数细胞处于M期。在细胞周期各期都有蛋白质合成，S期的蛋白质合成速度最大，M期最小。DNA合成仅发生在S期。RNA合成在G1、S和G2期，以恒定速度进行。细胞周期各时期的生化变化，实际是一个连续的过程，上一期生物合成为过渡到下一期作物质准备。因此，在细胞周期的任何一个时期的生物合成被阻断，都可以使整个增殖周期被抑制。例如，细胞从G1期向S期过渡，需要合成某些特殊RNA和蛋白质，这时若G1期细胞接受蛋白质合成的抑制剂（如嘌呤霉素）的处理，或G1后期细胞经RNA合成抑制剂（如放线菌素D）处理后，均可阻止G1期细胞进入S期。同样，处于S期的细胞如用DNA合成抑制剂（如氨甲喋呤、阿糖胞苷）处理后，可阻碍其进入G2期。秋水仙碱能干扰纺锤体形成，细胞被阻断在M期。总之，任何一种可以中断细胞增殖的因素（药物或射线），都是通过干扰某一时相的生物合成而抑制细胞生长的。 细胞完成一次细胞周期所需要的时间称为细胞周期时间（time of cell cycle, TC），因此细胞生长的速度同TC的长短有关。正常细胞和肿瘤细胞相比较，TC大致是相接近的，如人的正常肠上皮细胞的TC一般为1～3天，结肠癌细胞TC约2.5天；急性白细胞的TC是2～4天，而正常白细胞的TC是1天。由此可见，肿瘤细胞的增殖速度并不比正常细胞快，所不同的是正常细胞的增殖达到一定的限度就停止了，而且增殖的细胞数基本上相当于丢失的细胞数，总数始终保持相对恒定；肿瘤细胞虽然增殖速度不比正常细胞快，也可能有少数的丢失，但是它们是以持续的无限制方式增殖，在培养条件合适时，瘤细胞数量的增加永不停止。细胞周期时间和细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异。一般说来，哺乳动物的细胞周期为10～30小时。其中S期、G2期及M期加在一起约为10小时，不同细胞的变异程度较小，而G1期持续时间差别则较明显。

M期细胞分裂全过程持续时间一般为30～60分钟，但因细胞种类不同和温度变动，分裂时间有一定差别。由于细胞长期传代、反复冻存等因素影响，培养细胞中有异常分裂相现象。 5、培养细胞的生命期

多数二倍体细胞在体外培养中维持有限的生存期，最多生存一年左右，人成纤维细胞可传30～50代，相当于150～300个细胞周期。不同组织来源、取自不同年龄个体的成纤维细胞平均寿命是不同的。取自年轻个体成纤维细胞的寿命比年老者长。同年龄的个体健康差异又影响培养细胞的寿命。不同种族的动物细胞寿命亦不同，如人胚成纤维细胞能传50代，恒河猴皮肤成纤维细胞寿命为8代左右。培养人皮肤成纤维细胞生命的全过程大致经历以下三个阶段。

第I阶段 原代培养期（primary culture）。从体内取出组织细胞接种，进行原代培养，原代细胞一般持续1～4周，是二倍体核型。此期细胞常活跃地移动，极少见细胞分裂相。原代细胞与体内原组织相似性大，细胞是异质的（heterogeneou），细胞间相互依存性强，细胞软琼脂集落形成率和克隆形成率很低。细胞转化可能性极小，适宜进行疫苗制备、药物测试、移植等实验研究。

第II阶段 传代期。原代培养传代后称为传代细胞（subcultured cell）。原代细胞传代后便成为一有限细胞系（finite cell line）。在适宜培养条件下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存，其与原代细胞有同样的形态和使用价值。目前，常用细胞系均在10代内冻存。如不冻存，反复传代有可能丢失二倍体性质。原代细胞一般传到10代左右就不易传下去，大部分细胞出现退化，甚至死亡。仅极少数细胞度过危机，这些存活细胞再传代40～50代后，增殖缓慢以至完全停止，细胞进入第III阶段。 第III阶段 衰退期。细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，细胞衰退死亡。

在细胞生命阶段少数情况下，由于不明原因的影响，任何一个阶段都可能发生自发转化（spontaneous transformation）。转化的标志之一是细胞获得不死性（immortality），即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系或连续细胞系（continuous cell line）。培养细胞转化成一个细胞系的可能性，很大程度取决于培养细胞的动物种属。小鸡是一个“稳定”的种，它的细胞培养物不能自发转化、小鼠细胞自发转化的可能性最高，几乎鼠胚成纤维细胞的每个大量培养，都能得到连续细胞系。大鼠、金黄地鼠成纤维细胞自发转化率也是相当高的。健康成人除淋巴细胞培养可获得淋巴样细胞系外，其它细胞培养成系株的可能性很小。无限细胞系的形成主要发生在II期，III期比较少见。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（heteroploid）。转化后，细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性而无恶性，需做动物致瘤试验、软琼脂培养、凝集试验等来确定。目前实验中常用的无限细胞系有3T3-Swiss albino、NIH3T3、BHK-2等，属异倍体核型，它们易在基质上铺开，在低血清培养基内不生长（常用15％血清），在半固体培养基内形成很少集落，但细胞保持接触抑制，而且同源动物无致瘤性，它们是良性无限细胞系。但这类细胞在性质上已接近恶变细胞，有可能发生恶性转化。在无恶性转化前提下才可做进一步实验。各种癌细胞株能在软琼脂低血清中生长（常用10％血清），它们可使裸鼠或去胸腺动物致瘤，是恶性无限细胞株。

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实验五 鸡胚成纤维细胞原代培养

一、目的：鸡胚成纤维细胞的培养是动物细胞培养的基础实验之一，通过本实验了解鸡胚成纤维细胞的分离、培养技术及其体外生长的特点，掌握动物细胞体外培养的基本方法。

二、原理：应用胰蛋白酶处理鸡胚组织，使成纤维细胞呈单个、游离状态，在培养液中成纤维细胞呈现典型的贴附式生长。

三、材料：9～12天的鸡胚。 四、仪器设备及用具

仪器：CO2培养箱、超净工作台、CO2钢瓶、倒置显微镜、恒温水浴摇床、离心机 用具：手术器械：手术剪2把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、眼科镊（弯头、直头各2

把）

玻璃器皿：培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5各3个） 细胞计数室1个

刻度离心管（10ml带盖）10个 滴管套管10个 滴管一筒

塑料用品：20ml培养瓶2个、40ml培养瓶2个

6孔培养板1块（放置鸡胚）

移液器（5ml、1ml、200ul、50ul各1把）

吸 头（5ml、50ul各10个，1ml、200ul各50个） 吸头盒2个 其他用品：不锈钢饭盒

100目、200目细胞筛各1个 五、试剂和培养基

无Ca、Mg PBS、DMEM培养液、2.5％胰蛋白酶液、小牛血清、75％酒精、0.1％台盼蓝、双抗 六、实验步骤

1、 实验前的准备：在本次试验前必须完成以下准备工作 （2） 孵化至9～12天的鸡蛋（鸡胚）。 （3） 各项实验用品的消毒。

（4） 无菌室、超净工作台的清洁、消毒、 2、 实验操作：

（1） 在超净工作台内将鸡蛋置入6孔板上，令气室端（钝端）向上，用酒精棉球消毒蛋壳，待酒精挥发后，用

弯剪刀环行剪除气室端卵壳，切开壳膜，暴露出鸡胚，用镊子将鸡胚取出置入培养皿中。

（2） 剪去鸡胚的头、翅、爪，其躯体用不完全培养液洗三次，再用眼科剪剪成3mm3左右的组织块。 （3） 切碎的组织块用不完全培养液洗三次，再用无Ca、Mg PBS洗两次。 （4） 加入适量的0.25％胰蛋白酶（用无Ca Mg PBS稀释），每个鸡胚加20ml，置于37℃水浴箱中振荡消化30分

钟，以悬液中组织块漂浮不易下沉为度。吹打、镜检，细胞已单个分散即可终止消化。

（5） 悬液经100目细胞筛过滤，收集滤液于10ml离心管中，1000转离心10分钟，再用不完全培养液洗两次，

用0.1％台盼蓝染色计算活细胞数。

（6） 将细胞悬液用DMEM培养液（含15％小牛血清）稀释至5×105个/ml，接种至培养瓶或培养板中，置入37℃、

5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养，每天观察细胞的生长情况，视情况隔天换液，待细胞长成单层后，可传代培养。

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实 验 流 程

将鸡胚置于平皿中，剪去头、翅、爪

不完全培养液洗三次

将鸡胚剪成3mm3左右的组织块

不完全培养液洗三次

无Ca、Mg PBS洗两次

将组织块移入培养瓶中

加入0.25％胰蛋白酶液20ml

37℃、30分钟；终止消化

吹打细胞悬液，经100目细胞筛过滤

1000×g、离心10分钟

不完全培养液洗三次，细胞计数

稀释至5×105个/ml

接种，置37℃的CO2培养箱内培养

每天观察

视细胞生长情况隔天换液

七、实验的关键和注意事项

1、 所选用的鸡胚必须保证成活、无菌。

2、 每次冲洗组织或细胞时，离心力不可过大。

3、 由于钙、镁离子会影响胰蛋白酶的消化能力，在消化前宜改用无Ca、Mg PBS洗两次。 4、 胰蛋白酶的消化时间不可过长，以免影响细胞活力。

5、 接种时的细胞浓度过高或过低均会影响细胞生长，一般以5×105个/ml为宜。 八、实验结果与分析

本实验要求做到连续培养一周不发生污染、细胞在培养瓶内铺满单层。

实验六 小鼠肝细胞培养

一、目的：上皮细胞培养是研究细胞结构与功能的主要材料，而肝细胞培养是上皮细胞培养实验的典型代表。通过本实验熟悉大鼠肝细胞的分离、培养方法，掌握哺乳动物上皮细胞的原代及传代培养技术。

二、原理：肝组织块在培养瓶中形成生长晕；用胰蛋白酶和胶原酶消化肝组织后游离出的肝细胞在培养瓶中形成单层；待原代细胞生长连接成片后，用胰蛋白酶和EDTA混合消化单层细胞，做传代培养。 三、材料：小鼠

四、仪器设备及用具：

仪器：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、恒温水浴摇床、离心机

用具：手术器械：手术剪2把、止血钳2把、毛剪1把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、

眼科镊（弯头、直头各2把）

玻璃器皿：烧杯（250、100、50、25ml各2个） 培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5各3个） 细胞计数室1个

刻度离心管（10ml带盖）10个 滴管套管10个

塑料用品：20ml、40ml培养瓶各2个

24孔培养板2块

加样器（5ml、1ml、200ul、50ul各1把）

吸头（5ml、50ul各20个，1ml、200ul各100个） 吸头盒2个 其他用品：不锈钢饭盒6个

100目、200目细胞筛各1个

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