矿物微生物浸出12 - 图文

为了分离培养所需细菌，还需配制好专供这种菌生长的Leathen或9K培养基。配好的培养基用蒸汽灭菌15min，然后在无菌操作下分装于数个事先洗净并灭菌的100mL三角瓶中。每瓶装培养基20mL，用洗净干燥的吸液管分别取1mL～5mL矿水样加到各三角瓶中，塞好棉塞臵于20℃～35℃恒温条件下，静臵培养（或振动培养）7天～10天。由于细菌生长繁殖，三角瓶中培养基的颜色由浅绿变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀（与空白对照），选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取1mL培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中，同样培养。培养液将比头一次更快的变红棕色。以后按同样办法反复转移培养，到少10次以上。每转移一次，接种量逐渐减少，只需1滴～2滴就可以，而所培养的细菌却越来越活跃，只需培养3天～5天就可把培养基中的Fe2+氧化为Fe3+。在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，又由于培养基中的高浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能生长繁殖，其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁硫杆菌则得到充分繁殖，活性越来越大。

可用如下方法对所培养的氧化铁硫杆菌进行初步检查和鉴定。

（1）肉眼观察如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿变成红棕色，最后产生高铁沉淀。

（2）重铬酸钾容量法测定 用重铬酸钾容量法测定培养液中亚铁变成高铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。

（3）显微镜观察 通过显微镜观察细菌的形成，是否具有氧化铁硫杆菌的形状特征。

用上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离纯种，上述分离过程要无菌操作，并且要作平板分离。但一般生产中应用，不需纯种菌。菌种培养好后，臵于冰箱（4℃）条件下保存，但过一定时间需重新转移培养。工业生产用菌的大量繁殖培养，须在专门的设备中进行。

平板分离（也可用斜面分离）的目的是把混合的具有氧化亚铁能力的细菌分离，获得从单一细胞来的纯菌种。方法是把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板，然后在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平板上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划线分散开，然后将划好的线培养皿在25℃～30℃条件下恒温培养。经10天左右就可以看到由单个菌株长成的很小的褐色菌落（可借解剖镜观察），挑选适当菌落用取样针转移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培养，一般7天左右培养液就可变成红棕色。将此培养液重新在固体培养基上划线分离，如此反复进行数次分离和培养，就可获得纯菌株。将这些由单一菌落来的培养物分别进行鉴定，具体方法可参见一般微生物方法手册。

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12. 2. 4 细菌生长曲线

微生物的生长繁殖过程，按其繁殖速度的快慢和活性大小，可以分成四个时期，即生长缓慢期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期。这几个时期可以用细菌生长曲线表示，如图12-2。

当细菌由一个环境转移到一个新的环境时，会出现一个逐步适应的缓慢生长期，这个时期细菌的生长繁殖速度很慢，细菌也不活跃。根据被培养细菌对环境的适应性，这个时期可能很短，也可能较长。比较正常的情况是2周～4周。如细菌在含硫化铜的培养基中培养，一般要2周～4周方可适应，如果细菌的养料不变，则转移当中的的缓慢期就很短，甚至没有缓慢期。在缓慢期之后，随着细菌对环境的适应，开始进入对数生长期。这个时期细菌生长非常活跃，以对数增长的速度繁殖，此时细胞数目大量增加，对数生长期的曲线斜率就是细菌生长率μ：

??1dnd(logn)? （12-1） ndtdt式中，n----细菌浓度（个/ml）； t----培养时间（d或h）。

这个时期细菌也死亡，但新增加的细菌数目远超过死亡的细菌数。

图12-2 微生物生长曲线

在对数生长期之后，细菌进入稳定生长期，此时细菌死亡数目和新生数目大致相等，所以总的细菌数维持恒定。这个时期培养器内细菌的绝对数是最多的。但此时培养基中营养大量消耗，细菌已变得不太活跃，当进入大量培养或用于生产接种时，应当使用稳定期内尽量靠近对数期的细菌。

最后一个时期是衰亡期，在这一时期细菌开始大量死亡，培养器内总的细菌数目急剧减少。此时培养基中的营养物质已基本消耗完。以上是所有微生物生长繁殖所必须经历的四个时期，每个时期的长短和细菌的活跃程度受环境因素制约。

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12. 2. 5 浸矿细菌驯化

细菌依赖一定的环境而生存，改变一种细菌已适应的环境，会给细菌的生长造成不利的影响，过分改变环境因素，会造成细菌死亡。和所有微生物一样，浸矿细菌的细胞膜也有渗透性，该膜类似于半透膜，可以透过水分，但对其他物质有选择性。与其他生物细胞相比，细菌对渗透压的变化有较强的适应能力，但这种适应能力有一定限度。所以如果外界的盐分浓度过高，会抑制细菌生长，甚至会由于渗透压变化过大，造成细菌死亡。

重金属离子可使细胞蛋白质凝固，所以大部分重金属离子对细菌都有毒性作用，超过一定限度，细菌会因细胞脱水而死亡。非金属离子对细菌影响小些，但浓度过高也不行。如F-，细菌对它很敏感，浓度超过几个1×10 –6 %就会严重抑制细菌生长。

所幸的是，浸矿细菌对外界环境的变化有较强的适应能力，就是说有较大的可塑性。可以通过驯化的办法，使细菌逐步适应严酷的外界环境。办法是在逐渐变化外界条件的情况下对细菌进行转移培养，在驯化过程中，那些对新环境不适应的细菌死亡了，而某些活力较强的细菌会发生变异，演变成耐受性更强的细菌而活下来，形成新在耐性菌株。

培养细菌对某种金属离子耐受力的方法是：首先在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓度的该金属离子，然后接种入要驯化的细菌进行恒温培养，开始时细菌不适应，要较长时间才能生存，待细菌适应能正常生长后，将它再转移到含有更高浓度金属离子的培养基中继续培养，依此类推，每转移一次都提高金属离子浓度，如此进行下去，就可以获得对该金属离子具有较强耐性的菌株。表12-3、表12-4说明氧化铁硫杆菌对铀和铜离子适应力的驯化的结果。氧化铁硫杆菌对F -很敏感，末驯化的细菌，在F -浓度超过10×10 –6 %的环境就生长很困难，而通过驯化后，可在10g/L的F-离子浓度环境下正常生长，这充分说明，该菌的可塑性是很大的。

表12-3 氧化铁硫杆菌对铀适应性的驯化

铀浓度 （mg/L） 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 驯化前的细菌 4 4 4 7 7 7 7 不生长 氧化全部培养基中Fe2+所需时间（d） 第一次转移 4 4 4 4 4 4 10 10 不生长 第二次转移 4 4 4 4 4 4 4 7 10 10 不生长 第三次转移 4 4 4 4 4 4 4 7 7 7 10 第四次转移 4 4 4 4 4 4 4 4 7 7 10 432

表12-4 氧化铁硫杆菌对铜适应的驯化

铜浓度 （mg/L） 0 10 20 30 40 50 80 100 150 200 驯化前细菌 4 4 4 6 10 11 11 11 不生长 不生长 氧化全部培养基中Fe2+所需时间（d） 第一次转移 4 4 4 4 4 7 7 7 7 不生长 第二次转移 4 4 4 4 4 4 4 4 4 7 第三次转移 4 4 4 4 4 4 4 4 4 6

12. 2. 6 细菌的计量

培养到一定程度的细菌，在使用前须知道所培养菌液中细菌的含量或浓度。要对所培养菌液进行计量，一般用以下几种方法，其中比浊法和直接计算法可计量一定体积菌液中所含细菌的总数（包括活菌和死菌）。

（1） 比浊法

比浊法的原理是利用菌液所含细菌浓度不同，液体混合度不同，用分光光度计测定菌液的光密度的办法进行计算。由光密度大小，和标准曲线对比，可以推知菌液的浓度。

（2） 直接计数法

利用血球计数器，取菌液样品直接在显微镜下观察计数。

若测定单位菌液体积所含活菌数目，则须用平皿计数法和稀释计数法。 （3） 平皿计数法

将稀释成一定数的菌液，用固体培养基制成平板，然后在一定温度下培养，使其长成菌落，计算菌落数目，再乘以稀释倍数，则为所测菌液的活菌浓度。

（4） 稀释法

将菌液按10的倍数在培养基中连续稀释成不同浓度，然后进行培养。观察细菌能够生长的最高稀释度，此最高稀释度培养液中的细菌数目为1个，则可按总的稀释倍数计算出原菌液内所含活菌的浓度，一般达到正常繁殖情况下菌液活菌浓度为106个/mL～1010个/mL。

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