基因工程题库及答案汇编

10．EDTA 是一种螯合剂，可以抑制大多数酶的活性，但在下列酶中，( )不受它的影响 (a)外切酶Ⅲ (b)EcoRI (c)Bal31 核酸酶 (d)PstⅠ

11．S1 核酸酶的功能是( ) (a)切割双链的 DNA (b)切割单链的 RNA (c)切割发夹环 (d)以上有两项是正确的 12．Klenow 酶与 DNA 聚合酶相比，前者丧失了( )的活性。 (a) 5’→ 3’合成酶 (b) 3’→ 5’外切酶 (c) 5’→ 3’外切酶 (d) 转移酶 13．用Bal31 核酸酶作系列缺失突变时，( ) (a)缺失从一端开始 (b)需要 Mg 2作辅助因子 (c)需要Ca2作辅助因子 (d)以上有两项是正确的

＋

＋

14．在cDNA 技术中，所形成的发夹环可用( )

(a)限制性内切核酸酶切除 (b)用 3’外切核酸酶切除 (c)用 S1核酸酶切除 (d)用 5’外切核酸酶切除 15．λ外切核酸酶：( )

(a)作用时不需要模板 (b)可以从3’末端降解DNA (c)可以从 nick 部位降解 DNA (d)可以从gap 部位降解 DNA 16．T4RNA连接酶： ( ) (a)作用时不需要模板 (b)作用时需要模板 (c)是1972 年发现的 (d)是1967 年发现的 17．下列DNA不是λ外切核酸酶作用底物的是( )

(a)具有3’突出端的双链 DNA b)具有5’突出端的双链 DNA (c)切口DNA (d)平末端DNA 18．可以在切口部位起作用的酶是( ) (a) S1核酸酶 (b)外切酶Ⅲ (c) λ外切核酸酶 (d)Bal31核酸酶 择题(单选或多选)答案：

1．b； 2．a； 3．d； 4．C； 5．C；6．a，b； 7．b； 8．a； 9．C； 10．c； 11．d； 12．c； 13．c； 14．c； 15．a； 16．a，c； 17．C； 18．a 四、简答题

1． 按适当的顺序，列出将一种 mRNA的 cDNA 克隆到表达载体所用到的酶。 答： (1) 反转录酶以 mRNA 为模板复制出单链 cDNA；

(2) DNA 聚合酶以单链 cDNA为模板合成双链 DNA； (3) S1 核酸酶切割双链 DNA形成平末端； (4) 用限制性内切核酸酶切割载体； (5) 用 DNA连接酶将 cDNA 插入载体中。 2． 为什么反转录酶在聚合反应中会出错?

答：由于反转录酶缺少在 E．coli DNA聚合酶中起校正作用的 3’→ 5’外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的 dNTP和 Mg2+下，每 500 个碱基中可能有一个错配。 3． 什么是测序酶(sequenaseTM)?

答：所谓测序酶即是修饰了的 T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去 28个氨基酸，这样使 T7 DNA聚合酶完全失去了 3’→ 5’的外切核酸酶活性，只有 5’→ 3’聚合酶的活性，而且聚合能力提高了 3~9倍，测序时常用此酶。 4． 什么是 S1 核酸酶作图? S1 核酸酶作图是一种对 RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。 5． 基因工程中，为什么不喜欢用 BAP来脱去 DNA的 5’端的磷酸基团? 因为 BAP耐热和耐酚抽提。 6． RNaseA和 RNaseH在催化活性和应用上有何不同? RNaseA切单链 RNA，RNaseH切 DNA-RNA 中的 RNA。 7． 切口移位标记DNA前，用 DNaseI处理 DNA时，应注意什么? 应注意 Mg2+离子浓度和处理时间及温度。 8． 核酸酶与外切核酸酶Ⅲ用于系列缺失突变有什么不同? Bal31 核酸酶是对称缺失，而外切核酸酶Ⅲ是不对称缺失。 五、问答题

2．简述 DNA和 RNA连接酶的催化反应机制。

答： 所有已发现的DNA连接酶以及RNA连接酶在作用过程中都形成两种以共价键相接的中间产物，即： (1)酶与 AMP的络合物(E-A)；(2)底物与 AMP的络合物(DNA-A)。 催化反应分三步进行：

① 酶—核苷酸中间产物的形成：将 NAD或 ATP的腺苷酰基团转到连接酶的赖氨酸残基的ε-NH2 上形成酶—核苷酸中间产物，如果辅助因子是 NAD’，另一个产物就是 NMN，若是用 ATP作为辅助因子，另一个产物就是 PPi； ② 腺苷酰基团被转移到 DNA末端的 5’-P，将 DNA缺口的 5’端激活； ③ DNA缺口的 3’-OH同激活的 5’-P 形成磷酸二酯键，释放出 AMP。 3．影响 DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?

答：黏性末端链通常以 12℃～15℃最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在 DNA的退火问题，但是温度高于 30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高 10～100倍。DNA中有残存的 tRNA 不会抑制 DNA连接酶的活性，但是，如果 NaCl 的浓度高于 150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。 另外反应体系中有 NH4+离子的存在，对 E．coli DNA连接酶具有激活作用E．coliDNA 连接酶需要 NAD+作辅助因子，而 T4DNA连接酶需要 ATP。 4．什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?

答： Klenow酶是1974年 Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA聚合酶 I，得到两个片段，其中大片段的分子量为 75kDa，它具有 5’→ 3’聚合酶和 3’→ 5’外切核酸酶的活性，小片段具有 5’→ 3’外切核酸酶活性。 Klenow酶主要有下列用途：

(1)修复反应，制备平末端(2)标记 DNA3’突出末端(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行 DNA序列分析、用于 cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链 DNA探针等。 5．如何利用 T4DNA聚合酶制备 3’隐含末端或双链平末端?

答： T4DNA聚合酶具有 5’→ 3’聚合酶和 3’→ 5’外切核酸酶两种活性，在无 dNTP时， 该酶只有 3’→ 5’外切核酸酶活性；如只有一种 dNTP(如只有 dATP)，链的 3’端的降解则到出现该碱基(A)为止。这可使降解反应得到控制，产生一定长度的 3’隐含末端；当有 4 种dNTP(且浓度较高)时，则产生 3’平末端的 DNA。无论是降解还是合成反应，都是两侧同时进行。 6．如何利用 T4DNA聚合酶进行双链 DNA的 3，末端标记?

答：首先利用 T4 DNA聚合酶的 3’→ 5’外切核酸酶的活性在缺乏 dNTP的条件下切割双链 DNA，产生突出的 5’末端，然后加入放射性标记的 dNTP,利用 T4DNA 聚合酶的5’→ 3’合成酶的活性进行填补合成，得到两端的 3’端都是标记的双链 DNA 分子。如果被标记的双链 DNA中有限制性内切核酸酶的切割位点，则可以得到两段放射性标记的探针。 7．如何利用 T4DNA聚合酶制备平末端？

答：可用 T4 DNA 聚合酶将任何形式的双链 DNA 转变成平末端的双链 DNA。虽然Klenow酶能够进行这种反应，但是 T4DNA聚合酶是更好的选择，因为 T4DNA聚合酶的 3’ → 5’外切核酸酶的活性比 Klenow 酶强得多，并且在高浓度的 dNTP存在时，降解作用即会停止。根据这样一种特性，可以调整反应条件，用 T4DNA聚合酶的3’ → 5’外切核酸酶的活性将具有 3’突出末端的双链 DNA切成平末端；用 T4 DNA聚合酶的 5’→ 3’合成酶的活性将具有 5’突出末端的双链 DNA填补成具有平末端的双链 DNA。

8．反转录酶有两种类型，一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV，avian myeloblastosisvirus)，另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒

(M-MLV,Moloney murine leukemia virus)，它们之间有什么不同?

答： (1)AMV反转录酶是一个二聚体(α＝62kDa，β＝94kDa)，具有 5’→ 3’合成酶和很强的RNase H的活性。M-MLV反转录酶是一条多肽链，分子量为 84kDa 具有 5’→ 3’合成酶和较弱的 RNaseH的活性。当用长的 RNA合成互补的 cDNA 时，这种较低的 RNase H活性很有利。反应开始时，引物与RNA模板形成的杂交体正是RNaseH的底物，故cDNA合成一开始就存在 mRNA 模板降解和 DNA 合成起始之间的相互竞争。另外，如果反转录酶在合成过程中暂停作用，RNaseH就会在 DNA链 3’末端附近切割 mRNA模板，因此禽酶的高 RNase H的活性会影响 cDNA 的产量和长度。

(2)在反应温度上，AMV 反转录酶为 42℃，M-MLV 则是 37℃。鼠酶在 42℃下会迅速失活，因此对复制富含二级结构的 RNA来说，使用禽酶的效率高于鼠酶。但要注意，禽酶制品中常含有切割 DNA的内源核酸酶活性。

(3)反应的最适 pH：AMV反转录酶为 8.3，M-MLV反转录酶为 7.6。两种酶对 pH都非常敏感，即使误差为 0.2，反应产物也会大大缩短。由于 Tris 缓冲液的 pH 值随温度而变化，因此在实验中必须校正 pH值。

(4)DNA内切核酸酶的活性：在 Mn2+存在时，AMV反转录酶能够切割单链 DNA， 这种活性无专一性位点，对热稳定。而 M-MLV反转录酶没有此活性。

9．与 E．coliRNA聚合酶相比，细菌噬菌体的 SP6RNA聚合酶、T7RNA聚合酶和 T3 RNA聚合酶具有哪些优越性? 答： 首先，它们是非常高效的酶，可获得长度为几千个碱基的转录物；

第二是转录速度快，2μg 模板 DNA,在 30 分钟之内能够合成出 60μg 的转录物；

第三是起始转录的启动子序列非常特异，这对于进行链特异的放射性 RNA探针的标记非常有利； 第四，目前纯化的 T3 和 T7RNA 聚合酶是从过量表达的细胞中分离的，价格便宜，比活性高。 10．什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应?

答： 多核苷酸激酶能够把 ATP的γ-P转移到 ssDNA、dsDNA、ssRNA 或 dsRNA分子的 5 ’-OH端上。反应的方式有两种： (1)向前反应(forward reaction)

若 DNA的 5’端是羟基，激酶直接将 ATP的γ-P转移到 DNA的 5’-OH 末端。 (2)交换反应(exchange reaction)

如果 DNA的 5’端是 P的话，则该反应需分两步走，首先在过量的 ADP 存在下，T4多核苷酸激酶将磷酸化的 DNA5’末端磷酸转移到 ADP 上，然后再从[γ-32p]ATP上将标记的γ—P转移到 DNA链上，使其重新磷酸化。 11．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途? 答：主要差别是：CIP68℃时失活，而 BAP68℃稳定，且耐酚抽提。应用：

(1)dsDNA 的 5，端脱磷酸，防止 DNA 的自身连接。但是用 CIP 处理后，最好将 CIP 除去后，再进行连接反应。

(2)DNA 和 RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。

12．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?

答： λ外切核酸酶是从丸噬菌体感染的 E．coli 中分离纯化的，能够从双链 DNA上依次切下 5’单核苷酸，作用底物是双链 DNA的 5’磷酸末端，不能切割羟基化 5’端。该酶虽然能切割单链 DNA,但效率较低(下降 200 倍)。不能切割带切口或缺口的 dsDNA。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链 DNA突出的5’末端，以便让末端转移酶加尾。 13．Mn2 、Mg2对 DNaseI(deoxyribonucleasel)的活性有什么影响?DNaseI在基因工程中有什么作用?

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答： DNaseI是一种内切核酸酶，在 Mg 2+存在下，DNaseI随机切割 DNA两条链中的任意一条链；当 Mn2+代替Mg2+ 时，DNaseI几乎

是在双链 DNA 两条链相对的位置上打开缺口，使双链 DNA 断裂，产生的末端几乎是平末端或只突出 1~2 个核苷酸的 DNA 片段。 DNaseI有许多用途：(1)在切口移位标记中，制造切口；(2)在足迹法中保护 DNA；(3)除去 RNA 制备物中的 DNA；(4)体外转录中除去 DNA 模板；(5)检测染色体中的转录活性区；(6)产生可在噬菌体 M13 载体上进行测序的随机克隆。 14．比较 S1-Mapping和 Footprinting 在原理上、方法上、应用上海何不同? S1—作图(S1-mapping)和足迹法(footprintig)在原理上、方法上、应用上的差异列于 1：

第四章 质粒的分子生物学与质粒载体 一、填空题

1. 基因工程中有 3 种主要类型的载体： 、 、 。

2. 由于不同构型的 DNA 插入 EB 的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同， SC DNA 的泳动速度 ，OC DNA 泳动速度 ，L DNA居中，通过凝胶电泳和 EB染色的方法可将不同构型的 DNA分别开来。

3. 质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点开始的。然而，质粒的复制可以是 向的、或是 向的。在杂种质粒中，每个复制子斑点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下 的复制起点可能被关闭。

4. 就克隆一个基因(DNA 片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分： 、 、 。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。

5. 如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于 群，这是因为它们的 所致。 6. 质粒拷贝数是指细胞中 。

7. 复制子由三部分组成：(1) (2) (3) 。 8. 酵母的 2μm质粒有 ，可以配对形成哑铃结构。

9. 一个带有质粒的细菌在有 EB 的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫 。

10. pBR322 是一种改造型的质粒，它的复制子来源于 ，它的四环素抗性基因来自于 ，它的氨苄青霉素抗性基因来自于 。

11. 粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过 恢复该基因的性状。 12. ColEl 质粒复制的起始需要三种酶，即 、 和 。 13. YAC 的最大容载能力是 ，BAC 载体的最大容载能力是 。 14. pSCl01 是一种 复制的质粒。

15. 把那些没有可检测表型的质粒称为 。

16. 转座子主要由下列部分组成：(1) (2) (3) 。

17. pUCl8 质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和 两种质粒改造而来。它的复制子来自 ，Amp 抗性基因则是来自 。 18. 在基因型的表示中，符号表示 ；符号△表示 。 填空题答案：

1． 质粒DNA；病毒DNA；质粒和病毒DNA杂合体。2． 最快；最慢。3． 单；双；具有低拷贝数 4． 复制区： 含有复制起点；选择标记： 主要是抗性基因；克隆位点：便于外源DNA的插入

5． 同一个不亲和； 复制机制相同。6． 质粒的份数同染色体的比值，即质粒／染色体。7． (1)复制起点；(2)复制IX；(3)复制终点 8． 两个599bp的反向重复序列。9． 质粒消除(或治愈)。10．pMB 1；pSCl01；pSF2124(R质粒)。11．回复突变 12．RNA聚合酶I；DNA聚合酶I；RNase H。13．1000kb：300kb。14．严紧。15．隐蔽性质粒。 16．(1)反向重复序列；(2)转座酶；(3)标记基因。17．pBR322和M13；pMBl；转座子。18．插入；缺失 二、判断题

1．迄今发现的质粒 DNA 都是环状的。

2．线性质粒同环状质粒一样都不带有宿主必需的基因。

3．有 a、b、c 三个质粒，因为 a 和b能够共存于一个细胞，a和 c 也可共存于同一个细胞，所以 b 和c一定能够共存于同一个细胞。 4. 插入元件(1S)也是一种转座元件，它除了有转座酶基因外，还有附加基因。

5. 如果两个不同的质粒可以稳定地共存于同一个细胞中，这两种质粒则属于同一个不亲和群。

6. 一个带有反向重复序列的双链 DNA 经变性后，复性时其单链可形成发夹环。 7. 能够在不同的宿主细胞中复制的质粒叫穿梭质粒。

8．任何一种质粒都可以用氯霉素扩增的方法，增加它的拷贝数。

9． 只有完整的复制子才能进行独立复制，一个失去了复制起点的复制子不能进行独立复制。

10．CsCl-EB 密度梯度离心法纯化 SC DNA原理是根据 EB 可以较多地插入到 SC DNA中，因而沉降速度较快。

11．质粒 ColEl 同 pSCl01共整合后，得到重组质粒 pSCl34，具有两个复制起点，这两个起点在任何细胞中都是可以使用的。 12．pBR322 可以用于黏性末端连接、平末端连接和同聚物接尾法连接，无论用哪种方法连接，都可以用同一种酶回收外源片段。 13．所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。 14．一般情况下，质粒既可以整合到染色体上，也可以独立存在。

15．ColEl 是唯一用作基因工程的自然质粒载体，它具有四环素抗性标记，因而很容易选择。

16．某一染色体 DNA经内切酶 Sal I切割后，产生了若干个具有黏性末端的 DNA片段，将这些片段分别在 T4 DNA连接酶的作用下自身

连接成环，然后导入受体细胞，都可以进行独立地复制。

17．如果细菌的某种表型特征在 UV处理下丧失后不再恢复，这种表型有可能是质粒赋予。 18．基因克隆中，低拷贝数的质粒载体是没有用的。 判断题答案：

1．错误。质粒也有线性的，如土壤中能够产生抗生素的链霉菌属的质粒。2．错误。线性质粒携带有编码宿主菌的主要表面蛋白基因。 3．错误。a和b能够共存于一个细胞，说明a和b具有不同的复制机制；a和c也可共存于同一个细胞，说明a和c具有不同的复制机制，但是不能说b和c一定能够共存。因为b和c的复制机制有可能是相同的，也有可能是不同的。

4．错误。插入元件除了携带有与转座有关的基因外，不带有其他附加基因。5．错误。只有不同的不亲和群的质粒才能共存于同一个细胞中。 6．正确。7．正确。8．错误。并非所有的质粒都能用氯霉素进行扩增，如氯霉素抗性质粒就不能。9．正确。

10．错误。在CsCl-EB密度梯度离心中，EB插入SC DNA的量较少，密度改变也较小，离心后停留在较高部位密度小的地方。 11．错误。一般使用质粒ColEl的复制起点。12．正确。13．正确。14．错误。一般情况下，质粒主要是独立存在。

15．错误。ColEl上没有四环素抗性基因，不能通过抗性筛选。 16．错误。 只有含有复制子的片段重接后才能复制。 17．正确。 18．错误。对于那些有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体。 三、选择题(单选或多选)

1．线性质粒复制的引物来自于( )

(a)细胞中合成的小分子 RNA (b)自身末端的端粒序列 (c)外加的寡聚 DNA (d)自身断裂的小分子 DNA 2．下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中，( )是不正确的

(a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数 (b)可以在氯霉素作用下进行扩增 (c)通常带有抗药性标记 (d)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子

(a)pBR322 (b)pSCl01 (c)pUBll0 (d)pUCl8

5．反向重复序列：( ) (a)可以回折形成发夹结构 (b)可以是某些蛋白的结合位点 (c)参与转座子的转座 (d)以上说法都不对 6．松弛型质粒： ( ) (a)在寄主细胞中拷贝数较多 (b)可用氯霉素扩增 (c)一般没有选择标记 (d)上述(a)、(b)两项正确 7．ColEl是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒： ( )

(a)是松弛复制型 (b)具有四环素抗性 (c)能被氯霉素扩增 (d)能产生肠杆菌素 8．同一种质粒 DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( )

(a)OC DNA>SC DNA>L DNA (b)SC DNA>L DNA>OC DNA (c)L DNA>OC DNA>SC DNA (d)SC DNA>OC DNA>L DNA 9．pBR322 是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自：( ) (a) ColEl (b)Ri 质粒 (c)pSCl01 (d)pUCl8 10．关于质粒的相容性，下面哪一种说法不正确? ( )

(a)不同相容群的质粒能够共存于同一个细胞 (b)质粒可以分成若干个不相容群，但不能分成若干个相容群

(c)如果 a、b 两种质粒不相容，说明它们的复制机制相同 (d)属于同一个不相容群中的质粒，不仅复制机制相同，且拷贝数和分子量也相同 11．关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?( )

(a)在不同的宿主中具有不同的复制机制 (b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 (c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 (d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率

12．能够用来克隆 32kb 以下大小的外源片段的质粒载体是( ) (a)charomid (b)plasmid (c)cosmid (d)phagemid 13．第一个作为重组 DNA载体的质粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 选择题(单选或多选)答案：

1．b； 2．c； 3．b； 4．c； 5．a；6．d； 7．a，c，d； 8．b； 9．c； 10．d；1 l_b； 12．a； 13．c； 14．a,c,d,e 四、简答题

1．YAC 载体具有什么样的功能性 DNA'序列?为什么在克隆大片段时，YAC 具有优性？

3．基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有( )被视为用作基因工程载体的天然质粒载体