基因工程题库及答案汇编

1．b； 2．C； 3．b； 4．C； 5．C；6．b，d； 7．c； 8．a，e； 9．b，c，d，e； 10．b；11．c； 12．a，b，c；13．b； 14．d； 15．d 16．b； 17．d； 18．d； 19．a； 20．d； 21．a； 22．d； 23．b 四、简答题

2．说明 SangerDNA 测序法的原理。

答： SangerDNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由 5，端向 3，端聚合(DNA 聚合酶参与了细菌修复 DNA 合成过程)；(2)可延伸的引物必须能提供游离的 3，羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的 3，羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用 4 种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得 4组长度不同的 DNA片段。通过比较所有 DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。

3．在酶切反应缓冲液中加入 BSA的目的是什么?机理是什么? 答：目的是保护酶活性，机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活。 4． Fredrick 和 McClarin等用一个由 13 个碱基对的 DNA片段与 EcoRI、反应，然后分离到酶和 DNA 共结晶的复合物，通过 X射线分析发现了什么?

答：发现：具有活性的 EcoRI是一个二聚体，它们同 DNA结合形成一个直径为 50A 的球形结构，两个 EcoRI位于 DNA的两侧。 5．有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用? 答：某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基，因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。另一种避免限制酶切割的途径是抑制 SAMase的活性，该酶制造 S—腺苷甲硫氨酸。某些限制酶作用时需要 S—腺苷甲硫氨酸。然而，噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反应。 6．某学生在用 EcoRI切割外源 DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。 7．在序列 5’—CGAACATATGGAGT-3’中含有一个 6bp 的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 答：回文序列是：5’-CATATG-3’

8．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：GAATCG，AAATTT， GATATC，ACGGCA?为什么? 答：GATATC；AAATUF，因为它们是回文序列。

9．用连接酶将 Sau 3AI(,bGATC)切割的 DNA与经 BamHI(G↓'GATCC)切割的 DNA连接起来后，能够被 BamHI 切割的机率有多大(用百分比表示)? 答：25％。

10．用 Klenow 酶填补的办法可使 5’黏性末端转变成平末端。这种方法常使 DNA 上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失? BamH I(G↓GATCC)； Taq I(T↓CGA)， BssHⅡ(G↓CGCGC)。 答： BssHⅡ不会。

11．请推测细菌的染色体上是否会有编码识别 8 个碱基的内切酶? 怎样验证?

答：关于这个问题没有明确的答案。这些酶的作用不仅仅限于噬菌体的感染，因为大多数噬菌体并不含有 8 个碱基序列的酶切位点，一种可能是 8 个碱基的酶是质粒整合后加上去的，作为质粒附加系统的一部分。

12．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么?

答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。 五、问答题

1．什么是细菌的限制—修饰系统(restriction-modificationsystem，R-Msystem)

答：细菌中有作用于同一 DNA 的两种酶，即分解 DNA 的限制酶和改变 DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一 DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。 2．细菌的限制—修饰系统有什么意义?

答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将 DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身 DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的 DNA 在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将人侵的外来 DNA分子降解掉。所以 DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。 3．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。

答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。基本原则：3—4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号；首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶坝，j 取词头后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以 I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。 8．双酶消化法(doubledigests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。

答：双酶消化法是绘制 DNA 中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化 DNA分子的基础上，然后再用这两个酶同时或先后消化此 DNA，根据它们的结果，构建物理图谱。 10．限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)。

当 DNA 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当 DNA 片段的插入、缺失或重复导致基因组 DNA经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA 多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。

11．计算下列三种酶各自在某染色体 DNA 序列上识别位点间的平均距离：

Alu I： 5’ AGCT 3’， EcoR I： 5’ GAATTC 3’ Acy I： 5’ GPuCGPyC 3’ 3’ TCGA 5’ 3’ CTTAGG 5’ 3’ CPyGCPuG 5’

(注： Py二任何一种嘧啶：Pu 二任何一种嘌吟)

12．在细菌质粒 pBPI的四环素抗性基因 tet R的中间有一个 HindⅡ的切点。用 Hind Ⅲ切割果蝇基因组 DNA，以 pBPl 为载体构建基因组文库。分子杂交证明克隆 15 带有果蝇的目的基因。用 Hind Ⅲ和 EcoRV对克隆 15 进行了酶切分析，电泳结果如图 15．1(用酶切的 pBPl质粒 DNA作对照)，旁边标出了片段的大小。

图 15．1 酶切电泳图谱 1～2： HindⅢ切割；3—4：EcoRV切割；5—6：HindIII+EcoRV；1、3、5 是质粒 DNA； 2、4、6是 15 号克隆。

(1)绘制含有插入片段和不含插入片段时的 pBPl 的限制性图谱，并标明四环素抗性基因的位置；

(2)如果用克隆在另一个与 pBPl完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针进行 Southern 印迹杂交，预测上述电泳图会出现怎样的杂交带 (3)如果用克隆 15 的果蝇 DNA片段作为探针进行 Southern 印迹杂交，放射自显影的结果又是如何? 答： (1) 酶切图谱示于图 A15.1

图 A15.1 限制性图谱

(2)除 No.2 的2.5kb，No.6 的1.5kb 和1.0kb 没有带外，其他都有带。 (3) (2)项中没有带的都有带，有带的都没有带。 13．为什么大多数内切酶被称为“限制”酶。

答： 大多数内切核酸酶是限制性的内切核酸酶，只在特定的位点(即一段特定的核酸序列或甲基化核苷酸)作用。另外，限制性内切核酸酶主要是用来切割外源片段(例如侵染的噬菌体 DNA)。噬菌体对宿主具有专一性，因为在其他生物中，其 DNA 会成为细胞限制系统攻击的对象。从这种意义上说是内切核酸酶限制了噬菌体的宿主范围。

14．据 Science 杂志报道：一种重要的遗传疾病可由导致 DNA中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。

答： 这要求基因座已被作图，其目的在于分离基因，测定核苷酸序列以及确定是否碱基替换突变。碱基替换突变可以改变 DNA修饰酶(例如甲基化酶、限制酶)的识别序列。

15．为了绘制长为 3．0kb BamHⅠ限制性片段的限制性图谱，分别用 EcoRI、HpaⅡ、EcoRI+HpaⅡ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离 DNA 片段，溴化乙锭染色后观察 DNA带型(图 15．2)。请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明 EcoRI和 HpaⅡ识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离(kb)。

图15.2 用 EcoRI、HpaⅡ单独切割及用这两种酶 图 A15．2 3．0kb的 BamHI片段的限制性酶谱 混合切割 3.0kb BamHⅠ片断产生的 DNA 带 数字表示片段的大小(kb)

答： 图 A15．2是 BamHI片段的限制性图谱。倒装法绘图是同样有效的，制作这种图谱的一种方法如下：画一条适当长度的线段表示 3.0kb 的BamHI片段，由于 HpaⅡ只切割一次，HpaⅡ的位点可以明确地定位，从片段的任一端起 1.6kb 处标出其位置。EcoRI切割片段两次，如果你从片段的任一端起 1.7kb 处确定 EcoRI位点的位置，你会发现它与 HpaⅡ的距离同那些用双酶消化所得到片段的大小不相符，因此1.7kb 的片段必定位于中间，两个 EcoRI位点必定离两端各为 0.4 和0.9kb。

第三章 DNA 和 RNA 合成修饰酶 一、填空题

1．连接酶(ligase)是一类用于核酸分子连接形成——键的核酸合成酶，有 DNA 连接酶RNA连接酶之分。

2．原核生物主要有两种类型的 DNA连接酶：E．coliDNA连接酶和 T4DNA 连接酶。基因工程中使用的主要是 T4DNA连接酶，它是从 T4 噬菌体感染的 E．coli 中分离的种单链多肽酶，分子量为——』Oa，由 T4 噬菌体基因——编码。E．coli DNA连接是由大肠杆菌基因一编码，也是一条多肽链的单体，分子量为 kDa。这两DNA 连接酶有两个重要的差异：第一是它们在催化反应中所用的能量来源不同，TDNA连接酶用 ， 而 E．coli DNA连接酶则用 作为能源。第是它们催化平末端连接的能力不同，在正常情况下只有T4DNA连接酶能够连接平末端E．coliDNA连接酶则不能。即使是调整反应条件，E．coli DNA连接酶催化平末端连接效率也只有 T4 DNA连接酶的 。

3．DNA连接酶的单位通常用 Weiss 单位表示，一个 Weiss单位是： 。

4．DNA聚合酶 I是 在 1965 年从大肠杆菌细胞中分离的，所以又称为 合酶。该酶由大肠杆菌基因 编码，是一种单链球蛋白，分子量为 109kDa，酶蛋白中含有一个 Zn 原子。

倍。该酶的 3’→ 5’外切活性既能作用于单链 DNA 也能作用于双链 DNA，不过作用于 的活性要强于 链。 6．反向转录酶(reverse transcriptase)是由 kDa 和 kDa 两个单位组成的二聚体，作用时以 RNA为模板合成 DNA。 7．从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将 ，同时释放出离的无机磷。催化反应时不需 ，但需要引物，单链 DNA是最好的引物单链 DNA 受体的长度最短需有 个 dNTP。具有 3，突出末端的双链 DNA是较好的反应底物。二价离子和DNA末端状态对催化反应影响较大，但是用

为辅助离子，可以催化任何形式的末端(突出的、隐含的、平齐的)加接单核苷酸，但突出的 3’端效率较高。以Mn2 ／Mg 2+ 作为辅助因子，

＋

5．T4 DNA 聚合酶与 Klenow酶一样，具有 5’→ 3’，聚合酶和 3’→ 5’外切酶两种性，但是它的 3’→ 5’外切酶的活性比 Klenow酶强

只能在单链 DNA或双链 DNA3’突出端加尾。

8．S1核酸酶(S1 nuclease)是从米曲霉(Aspergillus oryzae)中分离纯化的一种含 金属蛋白，分子量为 32kDa，是一种耐热的酶(37—65％)。 9． 在 S1 保护实验中，S1 切割的温度有两种：20℃和 45℃，这是因为：在 20℃时， ； 在 45~C 时， 。 10． 技术可以用来鉴定 DNA分子中与 DNA结合蛋白相互作用的特定序列。

11．真核生物有两种 DNA 连接酶，连接酶 I 主要是参与 ，而连接酶Ⅱ则参与 。

12．T4RNA连接酶是1972年发现的，并于1977年纯化。该酶是由T4噬菌体基因 编码，作用是不需要模板。它在体内的作用是参与 T4 噬菌体 ，它不参与DNA合成的连接，但在 中可能有作用。

13．DNA聚合酶 I的 Klenow大片段是用 切割DNA聚合酶 I得到的分子量76kDa 的大片段，具有两种酶活性： (1) ；(2) 的活性。

14．反向转录酶除具有以 DNA 和 RNA为模板合成 DNA 的 5’→ 3’合成酶的活性外，还具有4 种酶的活性： (1) ；(2) ； (3) ；(4) 。 15．RNA连接酶作用时除了需要 ATP和 Mg2 外，还需要 。

＋

16．DNA聚合酶 I是一种单体酶，分子量为 109kDa，它含有金属离子 。 17．为了防止 DNA的自身环化，可用——脱去双链 DNA 。

18．T4 单核苷酸激酶进行 DNA片段的 5’端标记时，主要是通过两种反应即 和 。

19．CIP催化脱磷酸时有两种最适温度，一种是 37℃，适用于 端脱磷酸；另一种是 56℃，适用于 端脱磷酸。

20．λ外切核酸酶可从双链 DNA 的 5’端依次切下 5’单核苷酸，但对不同末端的底物来说，作用效率不同， 最高， 最低。 21．EGTA是 离子螯合剂。

22．测序酶是修饰了的 T7 DNA聚合酶，它只有 酶的活性，而没有 酶的活性。 23．切口移位(nick translation)法标记 DNA的基本原理在于利用 的 和 的作用。

24．欲将某一具有突出单链末端的双链 DNA 分子转变成平末端的双链形式，通常可采用 或 。 25．反转录酶除了催化 DNA的合成外，还具有 的作用，可以将 DNA/RNA杂种双链中的 水解掉。 一、填空题

1．磷酸二酯。2，68；30；51；74；ATP；NAD；1／100。3．在37℃下20分钟内催化焦磷酸交换1nmol p到ATP 所需要的酶量 4．A．Komberg；Komberg；polyA。5．200；单；双。6．62；94。7．脱氧单核苷酸添加到DNA的3’—OH端；模板；3；C02+ 8．锌。9．S1核酸酶只切割DNA-RNA双链中的环出结构；S1核酸酶不仅切割环出部分，也能切割与环出的相对链 10．DNA足迹。11．DNA的复制；DNA的修复。12． 63；尾丝的装配； tRNA 的修复 13． 枯草杆菌蛋白酶；(1)5’→ 3’合成酶的活性；(2)3’→5’外切核酸酶

14． (1)5’→3’外切核酸酶活性；(2)3’→5’外切核酸酶活性；(3)DNA 内切核酸酶的活性(Mn2+，切割 SC DNA)； (4)解旋酶的活性 15． -SH。16． Zn。17． 碱性磷酸酶；5’端的磷酸基团。18． 交换反应；向前反应。19． 5’突出端；平末端和突出的 3’端 20． 5’突出末端；3’突出末端。 21． Ca2+。 22． 5’→3’合成； 3’→5’外切。

23． DNA 聚合酶 I：5’→3’外切核酸酶：5’→3’合成酶。24． S1 核酸酶切割；DNA 聚合酶补平。25． 核酸水解酶 H；RNA。

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二、判断题

1．T4DNA连接酶和 E．coli 连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接。 2．T4DNA连接酶和 E．coli 连接酶都能催化双链 DNA和单链 DNA的连接。

3．反转录酶能够以单链RNA或单链DNA为模板，在引物的引发下合成一条互补的DNA链。以 RNA 为模板合成的 DNA 是互补 DNA(complementary DNA，cDNA)。若是以DNA模板合成 DNA，dNTP 的掺人速度很低(约 5个核苷酸／秒)，比 T7DNA聚合酶的合成速度差不多低 100 倍。

4．以RNA为模板，，用反转录酶可同时产生单链和双链的 cDNA，双链 DNA是由自身引物引导合成。但这种自身引物引导的合成效率远低于外加寡核苷酸引物引导的合成。

5．Bal31核酸酶(Bal31nuclease)是 Ca2+依赖性的，在反应混合物中加入 EDTA便可抑制它的活性。 6．λ外切核酸酶不能在双链 DNA 的 gap 和nick 处切割 DNA。

7．当一个DNA结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后，就保护了它们的磷酸二酯键免遭切割，其结果，电泳胶上就有明显可见的空缺带(与对照相比)，这就是 DNA足迹法。

8．T4DNA连接酶和 E．coli 连接酶作用时都需要 ATP和 NAD+作为辅助因子。

9．多核苷酸激酶之所以能够用于 DNA片段的标记，是因为它能够将单个的32 P标记的单核苷酸加到每一 DNA链的 5’端。 10．在反转录过程中，使用 AMV比使用 M-MLV可得到较多的产物。

11．真核生物可能有两种 DNA连接酶，连接酶 I和连接酶Ⅱ都能在 DNA合成和连接中起作用。

12．DNA 聚合酶 I 有三种酶活性，其中 3’→ 5’ 外切核酸酶的活性在较多的 dNTP 存在下，常被 5’→ 3’合成酶的活性所掩盖。 13．用同一种酶切割载体和外源 DNA得到黏性末端后，为防止它们自身环化，要用 CIP将它们脱磷酸。 14．λ外切核酸酶的作用产物可以作为末端转移酶的作用底物。 15．用外切酶Ⅲ作系列缺失突变时，可以从突出的 3’端开始。

16．nick和 gap 的含义是不同的，前者指 DNA的单链中有较小的缺失，后者仅是断开了一个磷酸二酯键。 判断题答案：

1． 错误。E．coli 连接酶不能催化平末端连接。2． 错误。都不能催化单链 DNA 的连接。3． 正确。4． 正确。

5． 错误。加入 EGTA 可抑制活性，因为 EGTA 是 Ca2+螯合剂。6． 正确。7． 正确。8． 错误。前者需要 ATP，后者需要 NAD+。 9． 错误。 将 ATP 上的 32p 加到 5’端。

10． 错误。使用 M-MLV 反转录酶比使用 AMV 反转录酶得到较多的产物。原因是 AMV 反转录酶的 RNase H 的活性较 M-MLV 反转录酶高，所以在以 mRNA为模板的反转录过程中，使用 AMV 反转录酶，模板被降解得快，所以得到的产物较少。 11． 错误。DNA 连接酶 I 主要是参与 DNA 的复制，而 DNA 连接酶Ⅱ则是参与DNA 的修复。 12． 正确。 13． 错误。载体和外源 DNA 不能同时脱磷酸，一般将载体 DNA 脱磷酸。 14． 正确。 15． 错误。不可以从突出的 3’端开始，只能从突出的 5’端开始。

16． 错误。正好相反，nick 是断开了一个磷酸二酯键，gap 指 DNA 的单链中有较小的缺失。 三、选择题(单选或多选)

1．T4DNA连接酶是从 T4 噬菌体感染的 E．coli 中分离的，这种连接酶( )

(a)催化连接反应时既能以 ATP又能以 NAD 作为能量来源 (b)既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 (c)是一种单肽酶，分子量为 74kDa (d)既能催化单链 DNA连接又能催化双链 DNA连接 2．DNA连接酶在体内的主要作用是在 DNA 复制、修复中封闭缺口，( )

(a)将双链 DNA分子中的 5，磷酸基团同 3，-OH末端重新形成磷酸二酯键 (b)作用时不消耗能量 (c)需要Mn2+等二价辅助离子 (d)也可以连接 RNA分子 3．在长模板链的指导下引物延伸合成长的 DNA互补链时应选用( )

(a)T4DNA聚合酶 (b)Klenow酶 (c)大肠杆菌 DNA聚合酶 I (d)T7DNA 聚合酶 4．末端转移酶是合成酶类，( )

(a)作用时不需要模板 (b)在C02的存在下，可以在突出的 3’末端延长 DNA链

＋

(c)在 C0 2的存在下，可以在隐蔽的 3，末端延长 DNA链 (d)上述说法有两种是正确的

＋

5．在以下关于噬菌体 SP6RNA聚合酶特性的描述中，( )是不正确的。

(a)能够特异性识别 SP6 启动子 (b)可能在 DNA模板的切口(nick)处停止 (c)具有核酸酶活性 (d)用于体外标记 RNA探针。 6．在基因工程中，可用碱性磷酸酶( )

(a)防止DNA的自身环化 (b)同多核苷酸激酶一起进行 DNA的 5，末端标记 (c)制备突出的 3，末端 (d)上述说法都正确 7．从 E．coli 中分离的连接酶： ( )

(a)需要ATP作辅助因子 (b)需要NAD作辅助因子 (c)可以进行平末端和黏性末端连接 (d)作用时不需要模板 8．下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性 (a)λ核酸外切酶 (b)外切酶Ⅲ (c)单核苷酸激酶 (d)碱性磷酸酶 9．下列哪一种酶作用时需要引物? ( ) (a)限制酶 (b)末端转移酶 (c)反转录酶 (d)DNA连接酶