老酸奶HPLC检测

尊敬的老师您好！'

近两天， 一则关于“果冻，老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在网上疯传，因破皮鞋可以提炼出明胶。明胶是一种极为常见的食品添加剂，是从牛、猪等动物骨和皮中的胶原通过变性而制得的变性蛋白质，其化学组成与胶原基本相同，主要成分是胶原蛋白。老酸奶等乳制品为了保持其口感和外观，会适当添加明胶等食品添加剂，这是国家允许使用的。而皮革制成的明胶透明，无味，消费者根本无法将正规的食用明胶和皮革制成的明胶区分开来。

如何区分老酸奶等乳制品中添加的是食用明胶还是皮革废料提炼出来的工业明胶，这一难题一直困扰着广大分析工作者。迪马科技独辟蹊径，通过检测皮革水解蛋白来确认老酸奶等乳制品中明胶的来源。皮革水解蛋白是皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L-羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为含有皮革水解蛋白，即可判断该乳制品中含有由废弃皮革而来的成分。

迪马科技实验室开发了两种L-羟脯氨酸衍生方法，利用氨基酸分析柱，对L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法检测结果准确，可靠，方法稳定性好，可用于老酸奶等奶制品中是否含有皮革成分的鉴别，两种衍生化方法，方便您根据实际情况进行选择。

以下是老酸奶中L-羟脯氨酸的测定的详细检测方法：

老酸奶中L-羟脯氨酸的HPLC测定

1 仪器与试剂

1.1 仪器、器皿

1.1.1 HPLC+紫外检测器

1.1.2 Diamonsil AAA氨基酸分析柱 1.1.3 11 mL水解瓶

1.1.4 1.5 mL塑料离心管

1.1.5 20 mL玻璃具塞刻度试管 1.1.6 5 mL玻璃具塞刻度试管 1.1.7 0.22 μm针头式过滤器 1.1.8 2 mL样品瓶

1.2 试剂

1.2.1 甲醇 1.2.2 乙腈 1.2.3 正己烷 1.2.3 三乙胺 1.2.4 冰醋酸 1.2.5 磷酸氢二钠 1.2.6 磷酸二氢钠 1.2.7 L-羟脯氨酸 1.2.8 蛋白水解试剂：称取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL浓盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/L），然后加水定容至100 mL。

1.2.9 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL浓盐酸，然后用纯水定容至1000 mL。 1.2.10 衍生剂PITC溶液：将250 μL异硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10 mL。 1.2.11 三乙胺溶液：将1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。

1.2.12 衍生剂DNFB溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯（DNFB）溶于50 mL乙腈。 1.2.13 Na2B4O7缓冲溶液：称取1.91 g Na2B4O7·10 H2O，用50 mL纯水溶解。

1.2.14 氨基酸储备液：称取一定量L-羟脯氨酸，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，得到浓度为 0.05 mol/L的储备溶液。

1.2.15 氨基酸使用液：将储备液用0.1 mol/L HCl水溶液稀释，得到浓度为0.0003 mol/L的L-羟脯氨酸溶液。 1.2.16 磷酸盐缓冲溶液：0.02 mol/L Na2HPO4 和NaH2PO4水溶液。

2 实验方法

2.1 样品水解

(1) 称取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（1.1.3），加入蛋白水解试剂（1.2.8），旋紧盖子，振荡混匀，110 °C下反应24 h。

(2) 反应完毕，将反应液全部转移至100 mL蒸馏瓶中，75℃下减压蒸馏至近干。

(3) 用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液（1.2.9）分三次溶解残渣，并转移到20 mL玻璃具塞刻度试管（1.1.5），再

用纯水定容至20 mL，待衍生。

2.2 样品衍生

2.2.1 异硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法 （1）样品水解溶液衍生

量取200 μL样品水解溶液，置于1.5 mL塑料离心管中，加入100 μL三乙胺溶液（1.2.11）和100 μL衍生剂PITC溶液（1.2.10），混匀，室温反应1h，加入400μL正己烷（1.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μL下层溶液与800 μL水混合，经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。 （2） 标准溶液衍生化

量取200 μL L-羟脯氨酸使用液*（1.2.15），置于1.5 mL塑料离心管中，加入100 μL三乙胺溶液（1.2.11）和100 μL衍生剂PITC溶液（1.2.10），混匀，室温反应1h，加入正己烷400 μL（1.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μL下层溶液与800 μL水混合，经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。

*根据实际情况，氨基酸使用液浓度可进行调整，本方法中氨基酸使用液浓度仅供参考。

2.2.2 2,4-二硝基氟苯（DNFB）衍生方法 （1） 样品溶液衍生

取0.5 mL样品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度试管（1.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液（1.2.13）和0.5 mL衍生剂DNFB溶液（1.2.12），具塞摇匀，于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（1.2.16）定容至5 mL，混匀后经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。 （2） 标准溶液衍生

取0.5 mL L-羟脯氨酸使用液（1.2.15）置于5 mL玻璃具塞刻度试管（1.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液（1.2.13）和0.5 mL衍生剂DNFB溶液（1.2.12），具塞摇匀，于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（1.2.16）定容至5 mL，混匀后经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。