漆酶以及二氧化钛对木质素降解作用的研究

漆酶以及二氧化钛对木质素降解作用的研究

摘要

木质素的降解受到生物催化与光催化的作用，那么它们二者到底是单独还是共同作用的时候对木质素的降解更为高效呢，我们这里予以考察。在这里漆酶作为一种生物催化降解剂，而二氧化钛则是作为光催化降解剂。它们被用于单步反应以及双步反应中。为了方便对比，我们考察了漆酶以及二氧化钛分别单独作用时对木质素的降解效果。反应条件控制为50 ± 1 °C, pH 5.0，木质素（分子质量约16000—175000）浓度为1.0 g/L，双氧水在这里被用作催化剂，来增强漆酶以及二氧化钛的降解效力。结果显示双氧水在二氧化钛降解木质素的过程中有着显著的作用：脱木质素效率达到了百分之百。通过气相色谱法我们发现双氧水与二氧化钛形成复合物的过程。此外，实验过程中我们发现漆酶和二氧化钛不仅能完成对木质素的降解，在降解过程中还产生了一些非常有用的副产品，例如琥珀酸和丙二酸。实验中发现这点也是十分值得作进一步研究讨论的。

1介绍

木质素在自然界含量丰富，树木、植物以及农作物中都含有木质素，木质素与纤维素、半纤维素一起构成了植物组织的主要成分。木质素是由四种醇单体形成的一种复杂酚类聚合物。木质素难以被消化或破坏，而且因为木质素的棕色色泽，它在造纸工业长期被当做一种废料，传统的白色纸张制造工艺中经常利用氯或氯化物的漂白作用来移除木质素，而这样的工艺就会产生许多氯废料，例如氯酚一类物质，这些有毒物质都不能直接排放，必须得经过处理解毒后才能避免对环境的污染。保留的残渣由纤维素、半纤维素以及其他碳水化合物组成。虽然木质素经常被认为是一种没用的产品，但它却含有碳、氢、氧这些非常有用的元素。通过正确的处理过程，木质素可以作为生物燃料的原料。然而，木质素的高度异构化及其复杂的化学成分使得它需要通过降解来提高它的可用性。

关于木质素的生物降解，之前已经有过这方面的研究，即从白腐真菌分离出的一种胞外酶对木质素的降解作用。这种酶——含铜复合物的漆酶，十分温和而且环保。漆酶通过接受来自铜的电子，传递给分子态的氧并使其还原为水，来催化底物的氧化。漆酶用来生物漂白牛皮纸浆（一种几乎是纯纤维素构成的纸浆）的作用已经被广泛研究过，这也是因为其脱木质素的作用。然而漆酶单独存在时的生物修复能力却受到限制，因为它只是专一作用于木质素中的酚类化合物并排斥其他化合物。据调查，1-羟基苯并并三唑（HBT）、2,2-二硝基二苯二硫（ABTS）、紫脲酸（VLA）、以及四甲基哌啶（TEMPO）这些试剂可以使漆酶的作用对象扩大到木质素中的非酚醛单位。然而这些试剂都很贵而且有些含有亚基，比如N–(OH)–，这些亚基会产生有毒化合物。 半导体的晶格间隙比较大，有人认为，将光半导体材料引导的光催化过程应用于酶降解，可以提高酶的降解效率。例如，曾有研究，从黄孢原毛平革菌菌体提取的漆酶，在经过二氧化钛参与的光催化预处理之后，对三硝基（TNT）的降解效率有显著的提高。此外，Paralta-Zarnora等人证实了，经过二氧化钛光催化预处理的漆酶的降解效率还受到辅助材料、介质以及颜色的影响。

二氧化钛是一种很有前景的光触媒，而且对木质素的降解有特别的潜力。人们对于将二氧化钛用作环境友好型材料的研究越来越感兴，因为它十分廉价，而且十分稳定，抗氧化。二氧化钛也能够抵抗大多数有机污染物的光氧化破坏作用，当它吸收了紫外线，就能够开始降解那些有机物。

我们应该是首次将光催化氧化过程（二氧化钛和紫外线）与生物催化过程（漆酶）结合起来降解大分子木质素的人，我们希望能够通过这个结合降解过程，提高木质素的降解效率。我们进行了多组重复实验（单一对照以及二者对比两个阶段）来对我们的假设进行研究。为了方便对比，我们考察了漆酶以及二氧化钛分别单独作用时对木质素的降解效果，同时我们也对双氧水在降解过程中的作用进行了检测。此外，还有待研究的是木质素降解过程中所产生的一些中间产物，这些产物可能有在生物领域有潜在的，有待开发的应用。总的来说，我们做这个研究，是为了使漆酶或者二氧化钛，或者二者一起，作为环境友好型产品，成为氯和氯化物之外的另一种取代品，它们的反应条件比较温和。或者，也可以将它们应用于生物工程的上游处理过程中。

2实验过程

2.1试剂

漆酶（0.72 unit/mg），邻苯二酚（C6H4-1,2-(OH)2）,双氧水[30% (w/w) H2O2]，木质素（碱性，分子质量16000—175000），二氧化钛（99.9%），3，4-二甲氧基苯甲醛（C9H10O3），硫酸(H2SO4)，醋酸钠(CH3COONa·3H2O)，醋酸(CH3COOH)，盐酸(HCl)以上试剂是从西格玛奥德里奇大学（英国）购买的；N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺（BSTFA,99%），二恶因以及吡啶是从费舍尔科学院（英国）购买的。这些药品都是分析纯级别而且不需要进一步提纯。蒸馏水经过密理博公司（英国）生产的Milli-Q 水纯化系统去离子过的。

2.2 其他实验仪器

注射器(BD Plastipak, 5 mL)以及注射过滤器(Millex-LCR, 0.45 μm)是从费舍尔科学院（英国）购买的。光化学反应是在一个配置有6×4 W(飞利浦TL-5W / 08、荷兰)紫外线管的紫外线室中进行的。紫外线管发出波长为315–400 nm的紫外光，这些光线具有很强的光化学和荧光效果。UV箱以及控制器都被建在一个小的工作室中(生化工程学院，谢菲尔德大学).。在整个反应阶段，温度都受到严格的控制，控温装置包含一块集热板（self-adhesive heater mat, RS Components, U.K.），油浴器（将矿物油装在耐热玻璃皿）以及散热风扇(Bisonic, model 12p-230MB, Tubeaxal Fan, Bisonic Technology Corp., U.K.).紫外线的强度通过光和有效辐射仪（QSL-2100, Biospherical Instruments, Inc., U.K.）来测定，并将其强度调整为5.30 ± 0.10 μE cm–2 s–1。实验中使用的UV箱的原理图见补充信息中的图S1。

2.3 木质素降解反应过程

通过实验（每组都至少有两个平行组）来比较漆酶以及二氧化钛对木质素的降解能力，同时也测定了过氧化氢对于反应的催化效果。实验详细过程如下：（1）、紫外线照射下的木质素降解（控制变量，每组照射条件相同），（2）当过氧化氢存在时的木质素降解（控制变量），（3）漆酶单独作用降解木质素(酶催化降解)，（4）二氧化钛单独作用（化学催化降解），（5）过氧化氢存在时漆酶的降解作用，（6）过氧化氢存在时二氧化钛的降解作用，（7）在第一步反应中加入漆酶和二氧化钛同时作用，（8）先在第一步反应中加二氧化钛，再在第二步反应中加入漆酶，进行降解，（9）过氧化氢存在时，在第一步反应中同时加入漆酶以及二氧化钛，（10）过氧化氢存在时，在第一步反应中加入二氧化钛，第二步反应再加入漆酶。 进行多组实验探究紫外线、过氧化氢、温度以及pH对酶催化以及二氧化钛催化过程的影响(这些数据在补充信息中图S2—S18中一一描绘)。结果显示在没有过氧化氢存在时，紫外线对漆酶的降解作用影响不大。不加入过氧化氢以及加入过氧化氢二者对于脱木质素的效

率有接近2—3以及1—2%的区别。将温度的测量范围定在30—70℃，而pH的测量范围为3—11。测量发现，50±时漆酶作用的最适温度。与此同时，光反应在温度超过40℃时表现出稍微的不同。另外，pH在5—7对于漆酶的降解效率影响不大（参考补充信息）。综上所述，整个反应过程都控制在温度50± 1 °C以及pH5.0的条件下进行，时间为24小时，反应是在一个封闭的系统中进行的，反应时要搅拌，搅拌转速为110rpm。反应是在25mL锥形瓶中进行的，而反应体系的总体积为10mL。在酶降解（漆酶）反应中，反应体系的总体积是10mL,其中包含终浓度为2.5 units/mL的漆酶以及1 g/L的漆酶，其余为醋酸缓冲液（浓度为0.05Mm,pH为5.0）。整个反应过程在暗处进行，避免光反应的发生。对于光反应过程，反应体系中包含终浓度为3 g/L的二氧化钛以及1 g/L的木质素，缓冲液同样为醋酸缓冲液（0.05Mm,pH5.0）。整个反应过程在紫外线（5.30 ± 0.10 μE cm–2 s–1）照射下进行，反应在之前提到过的一个含有六个小UV盒(Philips TL-4W/08,荷兰)的大UV箱中进行。单步反应过程与光反应过程中的条件一样，用的一样的设备，环境条件等等，但是在反应起始时向反应体系中加入了终浓度为2.5 units/mL漆酶。对于双步反应，在50 °C条件下经过24h的紫外线照射之后，关闭紫外灯，再加入终浓度为2.5 units/mL的漆酶然后再在暗处反应24h，温度控制在50± 1 °C。

所有的实验都在向反应体系加入终浓度5.55 g/L的过氧化氢的条件下重复进行了一遍，通常都是在反应最开始加入过氧化氢溶液，唯独在双步反应的过程中，是在第二步加入漆酶的时候被一起加入的。

2.4分析方法

色度测定采用CPPA标准方法（H.5P的标准）,引自Archibald等人。通过氢氧化钠将样品的pH调整到7.6。吸光度是Ultraspec 2100 pro紫外可见分光光度计（英国）测定的，将吸光度转换为色度，采用的公式为：CU = 500(As/Ap)，标准曲线的制作是采用500铜铂钴标准溶液（此处浓度为0.132），木质素的降解百分比是通过测定其在280nm的吸光度，用的是Ultraspec 2100 pro紫外分光光度计，最终通过以下公式进行计算：降解率 = (降解钱木质素含量–降解后木质素含量) × 100/降解钱木质素含量。样品的测定采用的是GC超气相色谱-质谱法。样品需要经过过滤，采用0.45μm膜过滤器过滤除去二氧化钛粉末，经过处理后的样品试用盐酸调整pH至2，经过乙酸乙酯萃取，在经过蒸干器蒸干一夜。

3结果与讨论

3.1色谱分析

图一所显示的色谱表明双氧水能够提高漆酶以及二氧化钛的木质素降解效率，就算在双步反应中也有相同的作用，然后在加了漆酶和二氧化钛的单步反应中，双氧水表现出抑制作用。实验显示当双氧水存在时，降解作用提高到17%。 在没有过氧化氢参与时的单步反应以及双步反应中，色度分别减少了25%以及30%.双步反应的脱木质素效率比单步反应的脱木质素效率要高，因为铜离子的释放，如上所述。然而当双氧水存在时，单步反应和双步反应的脱木质素效率表现出明显不同，单步反应降低了20%而双步反应达到了100%的降解

在单步反应中，二氧化钛，紫外线以及双氧水都在反应开始时被加入到反应体系中，氢氧根离子在这种体系中都结合到铜离子上，使得水中的氧气变少了。这个体系能够有效抑制漆酶的降解活性，并使光反应几乎不能够发生，氢氧根离子对于漆酶活性的抑制作用有很多文章中都有描述。（26）与此同时，在双步反应中，木质素和二氧化钛首先在UV箱中反应，然后再加入漆酶，第一步中光反应降解木质素55%，而第二步反应中（漆酶/水/暗环境）将

剩余木质素完全降解了。

3.2木质素降解作用

木质素含量的测定是通过紫外分光光度计测定其在280nm处的光吸收，图3展示了各种实验条件下，存在（不存在）双氧水时木质素的降解效率。这些结果反映出和色度测定时一样的降解趋势。紫外线照射下，木质素的降解效率下降了7%，而当双氧水存在时，降解效率提高了9%。在双氧水存在的条件下，漆酶的降解效率提高了45%，这显示出双氧水对于降解作用的有利影响。双氧水不仅参与完成整个反应，还扮演者催化剂的角色。此前也有许多人在漆酶降解木质素的过程中使用了催化剂。比如Bourbonnaiss等人（27）曾经测定在反应中加入小分子介体ABTS and HBT（0.05M醋酸缓冲液，pH5.0，反应24h）之后木质素的降解情况，降解效率提高了23.4%和22.5%。同时Oudia等人（28）测定了当存在紫脲酸的情况下漆酶的降解效率，结果发现提高了55%。光降解过程（二氧化钛/水/双氧水）使木质素降解了27%，这是单独使用二氧化钛和紫外线照射的结果。这样的结果是因为反应体系中越来越多的·OH和·O2-自由基。同时，在双步反应过程中，双氧水在第二步起始时被加入，它可以引导化学离子作为一种氢氧根自由基供体，在光反应过程中起作用。（29，30）这使得降解效率比没有双氧水存在下时双步反应的降解效率提高了30%

3.3小分子化合物的鉴别和测量

木质素降解过程中产生的小分子化合物是用气相色谱—质谱法（GC–MS）进行鉴别已经测量的，许多文献中都有此法演示（31,32），补充信息中的图S19和图S20展示了所有离子的色谱以及木质素降解过程中产生的化合物的测定色谱，包括二氧化钛催化降解、漆酶催化降解、漆酶和二氧化钛在不存在双氧水时单步反应和多步反应催化降解产生的所有化合物。 在木质素和木质素光反应降解过程中产生的相似化合物都经过了鉴定，但在木质素降解以后产生了更高的吸收峰。鉴定的物质主要是有机酸：醋酸、丙二酸、丁二酸、丁羟甲苯、香兰素、藜芦酸以及棕榈酸。木质素的光降解过程是随着?OH攻击苯环开始的，产生了领苯二酚、间苯二酚和对苯二酚。然后这些酚类的苯环断裂，产生丙二酸，接着产生短链有机酸，例如顺丁希二酸、草酸、乙酸和甲酸。此反应中，在最后产生二氧化碳（29,33）之前，二氧化钛以及紫外线催化降解产生了许多有机酸，例如琥珀酸、棕榈酸和乙酸。这意味着降解反应中，木质素中的酚类化合物被分解了。在Hasegawa等人利用水热氧化法降解木质素的过程了，也发现过这些有机酸（34）。然而在他们的实验中，降解过程的温度更高，而且他们所用的碱性木质素的分子量比我们实验中所用的木质素的分子量要小。

4结论

我们的实验展示了将二氧化钛和漆酶结合起来在单步和双步反应过程中对木质素的降解作用。结果与我们的假设相符合，即将二者结合起来降解木质素的效率比二者单独作用时要高。结果还显示了将光催化与生物催化结合起来时，为了得到最高的降解效率，最好是在分为两步进行，在第一步加入二氧化钛，第二步再加入漆酶，这样的反应设定比单步反应的降解要成功的多。结果还表明漆酶需要氧气来保证其高效降解作用。因为实用性，过氧化氢被用来充当供氧者。除了这些主要的结论之外，我们还利用气相色谱质谱分析法鉴定并测量了木质素降解后的产物。在这些产物的数据分析中，可能最值得注意的就是当双氧水存在时光催化过程中产生了大量的琥珀酸和丙二酸，这些反应的副产物可以用于生产各种有用的化学产品。