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三峡库区橡仁中总黄酮含量的测定
指导老师：*** 饶 靖、任 生
重庆三峡职业学院农林科技系 404155
摘 要：选取三峡库区不同区域常见的白栎、青冈栎两个品种的橡仁，以乙醇提取法结合超声波处理，选取提取温度、乙醇浓度、料液比，超声波处理时间四个单因素以及正交试验进行浸提，采用分光光度法对提取液中的总黄酮进行测定。实验结果表明，浸提因素中，超声时间>乙醇浓度>料液比>浸泡温度，最佳的提取条件为浸泡温度60℃，乙醇浓度70%、料水比1:20、超声波处理时间50min。对库区三个不同区域的橡子中总黄酮含量测定结果为：奉节县白帝镇龙井村1.49%，万州区新乡镇龙泉村1.26%，万州区龙宝龙宝山1.20%。
关键词：三峡库区、橡子、总黄酮、乙醇、超声波、含量
橡子（Quercus palustris）是壳斗科（Fagaceae）植物种子的总称，全世界有8属900余种，分布在温带、亚热带和热带，我国占6种301种[1]。在三峡库区有橡子种类16种，占全国种树的26.7%，以麻栎(Q.acutissima)分布最广，其次是白栎（Q.fabri)、枹栎(Q.glanduli fera)和栓皮栎(Q.variabilis)，是一种丰富的野生资源[2]。橡仁中含有高达50%左右的淀粉，还有脂肪、单宁、类黄酮、维生素、微量元素等有益物质。橡仁中的黄酮化合物具有降血压、调血脂、改善心肌供血供氧等作用，对高血压、高血脂、冠心病等心血管疾病均有良好疗效[4]。在国外作为猪饲料加以利用，在中国很早就有“木粮”“木玉米”的称号，在《本草纲目》 ：“槠子处处山谷有之，生食苦涩，煮炒乃甘，亦可磨粉”。可见我国用橡子生产淀粉已经流行很久[3]。
目前，橡子在开发利用方面只有个别研究部门的少量研究，与橡子分布广，储量大，可逐年不断地自然再生，纯天然的绿色食品资源的特点相比，利用率是非常低的。随着人们对橡子资源开发利用的认识越来越高，对三峡库区存在的大量资源加以开发利用的需要也越来越强，对橡仁中富有利用价值黄酮加以研究是非常必要的。本研究目的就是为三峡库区橡子资源的开发和利用提供借鉴和参考。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂
试验材料采摘于三峡库区奉节县白帝镇龙井村（1号）、万州区新乡镇龙泉村（2号）和万州区龙宝龙宝山（3号），采集时选取成熟、完好的自然落地的果实。样品采集选用大小均匀的橡子粒，除去杂质和外壳，切成1／8大小，在恒温干燥箱中50℃干燥24h，再粉碎过40目筛备用。
试剂：硝酸分析纯、乙醇分析纯、98.00%芦丁标准品、亚硝酸钠分析纯、硝酸铝分析纯、氢氧化钠分析纯 1.2仪器与设备
电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、分光光度计北京普析T6新世纪）、漩涡混合器（合肥艾米森mixplus）、恒温水浴锅（上海申贤恒温设备厂）、超声处理机KQ-100VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司)。 1.3方法
1.3.1 芦丁标准曲线绘制
准确称取烘干至恒重的芦丁标准品5mg，加 70％乙醇进行溶解并定容配成质量浓度为0.2mg/mL的芦丁标准溶液。精确吸取芦丁标准溶液0.0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、和3.0mL分别置于7支25mL具塞试管中（按顺序分别以0、1、2、3、4、5 、6号进行编号），然后加入70%乙醇至5mL，再分别加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.3mL，混匀，放置6min后分别加入质量分数为10%AL（NO3）3并用 70％乙醇定容至刻度，摇匀、放置 15min，以溶剂为空白，于 510nm处测吸光度值为纵坐标，得黄酮标准品芦丁标准曲线（图1）得回归方程：y=12.668x+0.00044，R2=0.998结果表明，芦丁浓度为0.004～0.024mg/mL的范围内与吸光度值关系良好
[5]。
0.350.3吸光度值0.250.20.150.10.05000.0040.0080.0120.0160.020.024浓度（mg/mL)图1黄酮标准品芦丁标准曲线
1.3.2 橡仁中总黄酮的测定
准确称取橡仁粉末 2g，加人 70％乙醇(1：10)，超声波振荡提取 10 min，取上清液 ；残渣再重复提取 2 次，合并 3次提取上清液 ，过滤、定容(70％乙醇 )至100mL容量瓶。摇匀，作为样品提取液。橡仁提取液的总黄酮显色测定方法同芦丁标准品。分别准确移取 2．5mL 橡仁提取液至 25mL 容量瓶中，加 5％ NaNO2溶液 1.0mL，摇匀 、放置6 min；随后加 10％ A1 AL（NO3）3溶液 1.0mL，摇匀,放置 6min。再加 4％ NaOH溶液 10mL，并用 70％乙醇定容至刻度，摇匀、放置15min，以溶剂为空白，于 510nm处测吸光度(A)，后根据黄酮标准品芦丁标准曲线回归方程得出总黄酮含量，平行测定 3次。 1.3.3 单因素实验设计
根据资料选取浸泡温度、乙醇浓度、料水比、超声时间4个因素作为考察对象，分别改变单一变量对橡仁进行浸泡前处理后，测定提取的总黄酮含量 [6]。 1.3.4正交试验设计
根据单因素实验结果，以超声时间、乙醇浓度、料液比、浸泡温度4个因素，选取3个水平，进行 L9（34)正交试验，测定提取液中总黄酮含量，对提取工艺进行优化。 2 结果与分析 2.1 单因素实验
2.1.1 乙醇不同浓度对橡仁中总黄酮提取的影响
以不加橡子样品的溶液做空白，在λ=510nm处测定。分别取样品5份，每份2g，加入60mL不同浓度乙醇（0%,30%,50%,70%,90%）提取30min，取上清液按1.3.2测定方法进行总黄酮提取量的测定。结果如图2：总黄酮提取量随着乙醇浓度先升后降，在70%的时候到达最高峰，得出最佳提取总黄酮乙醇浓度为70%。
1.41.210.8 含量%0.60.40.2000Pp?%乙醇浓度%图2 乙醇不同浓度对橡仁中总黄酮提取的影响
2.1.2不同料液比对橡仁中总黄酮提取的影响
在以不加橡子样品的溶液做空白，在λ=510nm处测定。分别取样品5份，每份2g，乙醇浓度为70%,乙超声处理30min,设置提取温度为60℃，料水比分别1:10,1:15，1:20，1:25，1:30取上清液1.3.2测定方法进行黄酮测得结果如图4，总黄酮随着温度先升后降，在1：20的时候到达最高峰，得出最佳提取黄酮最料水比是1:20。
1.41.21含量%0.80.60.40.201:101:151:201:251:30料液比图3 不同料液比对橡仁中总黄酮的影响
2.1.3不同超声处理时间对橡仁中总黄酮提取的影响
在以不加橡子样品的溶液做空白，在λ=510nm处测定。分别取样品5份，每份2g，以60ml70%乙醇为提取溶剂，分别超声提取20min,30min,40min,50min,60min，取上清液1.3.2测定方法进行总黄酮含量测得结果如图5。总黄酮的含量随着超声波处理的时间加长先升后降，在50min时达到最高峰，超声处理时间最佳是在50min。
1.341.331.321.311.31.291.281.271.261.251.24203040时间/分钟5060含量% 图4 不同超声处理时间对橡仁中总黄酮提取的影响
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