生物药物分析复习

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生物药物分析复习

绪论

药物分析的性质：应用化学，物理化学和生物化学的方法和技术对药物的质量进行全面控制

的学科。

药物分析的任务：药物研制过程中的“眼睛”；制定药物质量标准；生产过程中的质量控制；

开展临床药学研究；常规药品的检验。

*药品质量标准： 国家对药品质量及检验方法所做的技术规定。是药品生产，经营，使用以及检验和监督管理部门共同遵循的法律依据。 *中国药典的内容：凡例，正文，附录，索引。

药检工作基本程序：取样，鉴定，检查，含量测定，书写检查报告。

酶法分析（终点法，酶循环放大分析法，速度法）

是利用酶作为工具对特定物质（底物、辅酶、抑制剂和激动剂等）进行定量分析的方法。

终点法(总变量法 ) 测定原理：先借助酶反应（单个酶反应或几种酶构成的偶联酶反应）

使被测物定量的进行转变，然后在转变完成后，测定底物，产物或辅酶物质的变化量，因此称为终点法。

终点法的条件：1.必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品；2能够确定使

这种酶反应接近进行完全的条件；3.反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定；4.在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。

使用终点法测定应注意的问题：酶的底物的专一性（最好是绝对专一性）；反应的平衡；反应液中的酶量；反应产物的抑制。 终点法的种类

（一）单酶反应定量法：

1、底物减少量的测定：胞嘧啶（280nm）、腺嘌呤（280nm）和尿酸（293nm或297nm）。 2.产物增加量的测定：（1）各种氨基酸和草酸（2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA **3.辅酶变化量的测定（理解例子 学会如何进行实验设计和分析） 条件：测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶的底物的量。

原理：NADH和NADPH在340nm有特征最大吸收峰，而NAD和NADP在340nm却无这一吸收带，故可应用于NAD或NADP为辅酶的脱氢酶反应，通过测定340nm吸光度的变化，就可以对作用相应脱氢酶底物的物质进行定量分析。 （二）和指示酶反应偶联的定量法

**1.以脱氢酶为指示剂（理解例子 学会如何进行实验设计和分析） 2.以脱氢酶以外的酶作为指示剂

酶循环放大分析法具有化学放大作用，理论上可无限放大其灵敏度。是利用酶循环设计的一种超微分分析法。

步骤：转换反应，循环反应，指示反应 转换反应 ： 以试样中的待测组分为底物，经特异反应生成与待测组分相当的定量循环底物。 循环反应 ：生成的循环底物反复参加由两个酶反应组成的偶联反应，所得产物量为循环底物的若干倍。

指示反应 ：采用酶法测定反应产物。由反应产物量及循环次数，计算出循环底物量，再推算出试样中待测组分的量。

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酶循环放大分析法应用范围

1.有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定(NAD、NADP、CoA) 2. 能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶可测定（G ATP HK） 酶循环放大分析应该注意的问题:

1.在进行循环之前，必须完全除去转换反应中剩余的辅酶； 2.在循环反应中底物（不是辅酶）必须过量；

3.要用已知量的循环底物做循环反应和指示反应以求得循

免疫分析——利用抗原抗体反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）

的方法。

抗原与抗体 性质 及其相互作用

免疫球蛋白分子由两条重链（H链）和两条轻链（L链）通过不同数目的二硫键结成Y形。在抗体分子的N端为“多变区”（V区），是抗体分子与抗原决定簇的结合部位；抗体分子的C端为“稳定区”（C区），是抗体抗原特异性部位。

抗原抗体结合具有 高度特异性 。抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性则取决于抗体Ig Fab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。 抗原与抗体通过很弱的短矩引力而结合，如 范德华引力、静电引力、氢键及疏水性作用 等。

免疫扩散技术

基本原理 ：可溶性的抗原和相应的抗体在溶液或凝胶中彼此接触，形成不溶性抗原-抗体复合物沉淀。

双向免疫扩散基本原理 ：指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相

遇后形成一定类型的特异性沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。

双向免疫扩散的 应用 ：1.抗原、抗体相对含量测定；2.抗原、抗体相对分子量分析

酶免疫分析技术基本原理 ：指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它

采 用抗原与抗体的特异反应与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。

**酶联免疫吸附试验（ ELISA ） ：结合在固相载体上的抗原（抗体）与待检抗

体（抗原）酶偶联物（标记物）反应后，催化水解或氧化还原酶的相应底物呈色，其颜色深浅与待测抗原（抗体）含量成正比。

包被 ：指将抗原或抗体固相化的过程。它是通过物理吸附作用，一般靠疏水键连接。 封闭：指用封闭剂封闭经包被的固相载体表面残留的未饱和位吸附位点的过程。 常规使用的ELISA技术主要有：

直接ELISA：测抗原 间接ELISA：测抗体 *夹心ELISA：测抗原

*竞争ELISA：测抗体或抗原及半抗原

反向捕捉ELISA：测特异性IgM 单位点非竞争ELISA：主要测半抗原 细胞ELISA：测细胞表面抗原

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夹心ELISA

? 基本原理 ：样品中抗原与载体上抗体结合，经洗涤加入该抗原的酶标记抗体，洗

?

去未结合的酶标抗体，加底物显色，可定量测定抗原。

双抗体夹心法测抗原 ：应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载体包被和酶标抗体，以检测相应的抗原。此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原。

双抗原夹心法测抗体 ：用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。

? ?

此法适用于多价大分子抗原（血清中HBsAg、AFP和尿液hCG）的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。 竞争ELISA

? 竞争法测抗体 ：待测抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。当抗原材料

中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。

竞争法测抗原 ：待测抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。

放射免疫测定RAI基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的待检抗原（Ag）

同时与限量的特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑制反应，通过测定结合（ *Ag-Ab ）的或游离（ *Ag ）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。

免疫放射分析（ IRMA ）基本原理：用过量的核素标记抗体与待测抗原形成复合物，

并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段除去多余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。

*放射免疫与免疫放射原理的区别

IRMA与RIA的工作原理的主要区别 项目 反应机制 RIA（放射免疫） 竞争性反应 IRMA（免疫放射） 非竞争性全量反应灵敏度提高（10-100倍） 二种 标记抗体 一般需单抗作分离剂，抗原需两个或两个以上决定簇 与待测抗原呈正相关 反应试剂 分离方法 三种 标记抗原 抗原只需一个 抗原决定簇 待测抗原复合物 与待测抗原呈负相关 放射性 非特异性结合 待检抗原性质 主要影响高剂量反应 半抗原及大分子 主要影响低剂量反应 蛋白质、酶等生物大分子 ELISA操作要点： ? ?

加样 ：即加标本、酶结合物和底物，注意交叉污染和产生气泡。 温育 ：常采用的温度：43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）。

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? ?

洗涤 ：是ELISA最主要的关键技术，目的是分离游离的和结合的酶标记物。洗涤

方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）。

显色 ：影响因素：反应温度和时间；OPD底物液应避光显色，硫酸终止；TMB显色终止液：叠氮钠、SDS、各类酸性终止液。 比色 ：以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔）。

*生物检定 是利用生物体包括整体动物、离体组织/器官、细胞和微生物等评估药物生物活

性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一

定条件下比较 供试品 和相当的 标准品 或 对照品 所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。

生物检定的作用：

生物检定法具有独到的优势，主要表现在： (1)直接关切生化药物的有效性和安全性；

(2)量效关系确切，可为临床用药剂量的规范化提供参考； (3) 是反映产品质量的重要指标，具有专属性。

*生物检定在药物分析中的应用：1、药物的效价测定；2、大分子结构的测定；3、微量生理活性物质的测定；4、药物的毒性成分及有害杂质的限度检查；5、新药研究。

电泳技术的基本原理

电泳：带电粒子在电场中的定向移动。

在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。

电泳法:指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作用下，向其对应的

电极方向按各自的速度泳动而使组分分离，再进行检测或计算百分含量的方法。 颗粒在溶液中迁移的 驱动力 ：颗粒的有效电荷和电位梯度。

影响电泳速度的 因素 ：颗粒性质；电场强度；溶液性质；电渗；焦耳热；筛孔:

**聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳

基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。

**PAGE不连续系统的原理与技术

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种物理效应 ：样品的浓缩效应 ; 分子筛效应 ; 电荷效应。

样品的浓缩效应:①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③PH的不连续性 ④电位梯度的不连续性

*三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高。

⑴一般电泳分离的电荷效应：带电多，MW小，迁移快 ⑵不连续系统对样品的浓缩效应：迁移率，被压成薄层 ⑶凝胶对样品分子的筛选效应

影响蛋白质与SDS的结合程度的因素：溶液中SDS单体的浓度；样品缓冲液的离子

强度；二硫键是否完全被还原

**SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和技术

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