9102-2015.05.29-响应面法优化合浦珠母贝糖胺聚糖提取工艺的研究(1)

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响应面法优化合浦珠母贝糖胺聚糖提取工艺

周小双1, 2，王锦旭1，杨贤庆1, *，林婉玲1，魏涯1

（1. 中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加

工技术研发中心，广州，510300；

2. 上海海洋大学食品学院，上海，201306）

摘要：以合浦珠母贝全脏器为原材料，经解冻匀浆和热水浸提后，采用枯草杆菌中性蛋白酶和胰蛋白酶双酶酶解，sevage法除蛋白两次，清液醇沉得糖胺聚糖粗制品GAG，粗制品经DEAE-52离子交换柱纯化后得精制品。在单因素试验基础上，以粗制品得率与糖胺聚糖含量的乘积Y/(×10-4)为响应值，加酶量、液料比、酶解时间为影响因子，利用响应面试验分析法优化GAG的粗提工艺，得最佳提取工艺：加酶量为1.14%（枯草杆菌中性蛋白酶与胰酶的比例为7:8）；液料比为3:1；酶解时间为4.1 h。在此条件下，糖胺聚糖粗制品得率为0.518%，糖胺聚糖含量为10.9%，经DEAE-52柱纯化后的糖胺聚糖含量为89%。故采用响应面法优化合浦珠母贝糖胺聚糖提取工艺是可行的，有助于后期的生物活性研究。

关键词：合浦珠母贝；糖胺聚糖；响应面法

合浦珠母贝（Pinctada martensii），又称马氏珠母贝，双壳纲，珍珠贝科。1965年我国成功开展其人工育苗，自此海水珍珠养殖业迅猛发展[1]，在我国南方沿海海域均有分布。近几年对于合浦珠母贝的研究主要是遗传育种、珍珠层结构、插核育珠等[2]，而针对软体部贝肉的研究不多。目前，合浦珠母贝贝肉年产量达2 000 t以上，大多用作食材或饲料，利用率不高，亟待高值化开发利用，具有良好的应用前景。

糖胺聚糖（Glycosaminoglycans，GAGs），又名氨基多糖、酸性粘多糖，是蛋白聚糖整体分子结构中的“含糖片段”，其二糖单位为氨基己糖和己糖醛酸。现今确定的糖胺聚糖结构共七种，即硫酸软骨素C （CSC）、硫酸软骨素A （CSA）、透明质酸（HA）、硫酸皮肤素（DS）、硫酸角质素（KS）、肝素（HP）及硫酸乙酰肝素（HS）。研究表明，海洋贝类肉中糖胺聚糖具有多种生物活性，如增强免疫[3]、保湿作用[4]、抗肿瘤[5]、降血脂[6]、抗氧化[7]等活性，已有学者对翡翠贻贝[3]、近江牡蛎[6]、波纹巴非蛤[8]、四角蛤蜊[9]等多种贝类糖胺聚糖的分离纯化和理化性质进行了探讨。

响应面法（Response Surface Methodology，RSM）是结合数学方法和统计方法对所感兴趣的响应值受多个变量影响的问题进行建模和分析的，其目的是优化该响应值[10]。响应面法是一种确定最佳提取条件的简单有效方法，计算机能够生成非线性二次式模型[11]，包括中心复合设计和一个二阶多项式方程，来确定不同变量对响应值影响的显著性[12]。本文在前期研究的基础上[13]，利用响应面法优化合浦珠母贝肉中糖胺聚糖提取的工艺条件，为进一步的生物活性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1原材料与试剂

合浦珠母贝贝肉全脏器，购自广东省徐闻县，贝肉取出后-18℃冷冻备用。

枯草杆菌中性蛋白酶（酶活力100 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力250 U/mg）、木瓜蛋白

酶（酶活力800 U/mg），购自广州齐云生物技术有限公司；肝素钠（效价150 U/mg）、 1

基金项目：广东省公益研究与能力建设专项(2014A020217009)；广东省海洋渔业科技与产业发展专项科技攻关与研发项

目(A201501C08)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2014TS25)；农业部水产品加工重点实验室开放基金项目(NYBJG201408)资助。

作者简介：周小双(1991-)，女，硕士研究生，水产品加工与质量安全。（通讯作者：杨贤庆，男，研究员，yxqgd@163.com）

1,9-二甲基亚甲基蓝，购自Sigma；硫酸软骨素钠，购自中国食品药品检定研究院；甘氨酸、NaCl、NaAc、氯仿、正丁醇、无水乙醇均为分析纯。 1.2仪器设备

高速组织捣碎机；小型切向流超滤系统，美国MILLIPORE；pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）公司；Milli-Q超纯水机，美国MILLIPORE；J26XP高速离心机，美国贝克曼库特；紫外可见分光光度计，日本SHIMADZU；Alpha1-4冷冻干燥机，德国Christ；隔膜真空泵（GM- 0.33B）；TLJ-2型定时增力电动搅拌器，姜堰市天力医疗器械有限公司；HWS24电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；CBS-B程控多功能全自动部份收集器和BT-100SD定时电脑泵，上海青浦沪西仪器厂。 1.3方法

1.3.1粗提工艺

合浦珠母贝全脏器→解冻→加水匀浆→热水浸提→酶解→煮沸灭酶→10 000 rpm离心10 min，sevage法除蛋白→清液调pH至7.0，65%乙醇4 ℃醇沉24 h→离心分离沉淀→无水乙醇和丙酮洗涤→冷冻干燥得GAG粗制品。 1.3.2含量测定

糖胺聚糖的含量测定采用1,9-二甲基亚甲基蓝法[14]。 1.3.3酶量比例选择

以合浦珠母贝全脏器为原料，经解冻匀浆、热水浸提后分别按质量分数0.1、0.3、0.5、0.7、0.9%枯草杆菌中性蛋白酶和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0%胰蛋白酶的比例，在50 ℃、pH 7.5-7.7的条件下分别进行4 h单酶水解和双酶酶解，酶解液经sevage法除蛋白两次后醇沉的GAG粗制品，以粗制品得率与糖胺聚糖含量的乘积Y/(×10-4)作为指标，选择出最佳酶量比例。 1.3.4合浦珠母贝肉中糖胺聚糖提取工艺的单因素试验

选取对粗制品得率与糖胺聚糖含量有影响的三个因素，即加酶量、液料比、酶解时间，按照1.3.1提取合浦珠母贝肉中糖胺聚糖，以粗制品得率与糖胺聚糖含量的乘积Y/(×10-4)作为指标进行考察。

1.3.5响应面法优化合浦珠母贝肉中糖胺聚糖提取工艺

综合单因素试验结果，根据Box-Benhken的中心组合试验设计原理，本实验选取加酶量A、液料比B、酶解时间C作为三因素进行编码，糖胺聚糖粗制品得率与糖胺聚糖含量的乘积Y/(×10-4)为响应值，实验因子和水平设计如表1：

表1 响应面分析因子及水平表

Table 1 The factors and levels of response surface analysis

因子

加酶量A/%(g/g原料) 液料比B(mL/g原料)

酶解时间C/h

编码 A B C

0.80 1.80 2.80

水平 1.20 3.00 4.00

1.60 4.20 5.20

1.3.6精制工艺

取1.0 g GAG粗制品溶解于250 mL NaAc缓冲溶液（pH 6.0）后，上样至DEAE-52离子交换色谱柱，采用0.5 M NaAc缓冲液（pH 6.0）和1.5M NaCl各100 mL分别进行洗脱分离，以5 mL/管收集洗脱液后，以1,9-二甲基亚甲基蓝法测定各管样品中糖胺聚糖的含量，合并相同组分，将不同峰段组分分别进行超滤除盐、冻干后储存备用。

2 结果与分析

2.1酶量比例选择

如图1和图2所示，经单酶水解的结果表明，糖胺聚糖粗制品得率与含量的乘积Y随加酶量的增加提高显著，但当加酶量高于0.7%枯草杆菌蛋白酶和0.8%胰蛋白酶时有下降趋势，故枯草杆菌蛋白酶和胰蛋白酶的最适加酶量分别为0.7%和0.8%。

图1 枯草杆菌中性蛋白酶水解结果

Fig.1 Effect of enzyme dosage on the enzymatic hydrolysis by neutral protease of Bacillus subtilis

图2 胰蛋白酶酶解结果

Fig.2 Effect of enzyme dosage on the enzymatic hydrolysis by pancreatin

随后进一步确定枯草杆菌中性蛋白酶与胰蛋白酶的双酶最佳比例，结果见表2。经综合考虑粗制品得率、GAG含量及其乘积Y/(×10-4)三项指标，确定最佳酶量比例为7:8。

表2 枯草杆菌中性蛋白酶与胰蛋白酶不同酶比例水解结果比较

Table 2 Effect of ratio of neutral protease of Bacillus subtilis to pancreatin on the hydrolysis

酶量比例 粗制品得率/% GAG含量/% Y/(×10-4)

6:9 0.38 6.61 2.51

7:8 0.46 6.32 2.91

8:7 0.44 5.26 2.31

9:6 0.4 4.85 1.94

10:5 0.32 4.61 1.48

注：酶解条件为总加酶量1.5%、pH7.5-7.7、50 ℃酶解4 h。

2.2单因素试验及其分析

2.2.1酶解时间对糖胺聚糖粗制品得率与含量的影响

取50 g合浦珠母贝全脏器匀浆后，加入150 mL蒸馏水55 ℃热水浸提5 h后，加入质量分数1.5%的双酶（枯草杆菌中性蛋白酶与胰酶的比例为7:8），调节pH至7.5-7.7，在50 ℃下分别酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h。酶解后煮沸灭酶，离心去除杂质，sevage法除蛋白两

次，调节pH至7.0后加入无水乙醇至65%醇沉过夜，离心得沉淀，冷冻干燥后得糖胺聚糖粗制品，以Y/(×10-4)为指标。结果如图3所示，可知Y值随酶解时间的增加呈先增后减的趋势，在4 h处达最大值，故最适酶解时间为4 h。

图3 酶解时间对糖胺聚糖提取的影响

Fig.3 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of glycosaminoglycans

2.2.2液料比对糖胺聚糖粗制品得率与含量的影响

取50 g合浦珠母贝全脏器匀浆后，分别按1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的液料比加入蒸馏水55 ℃热水浸提5 h后，加入质量分数1.5%的双酶（枯草杆菌中性蛋白酶与胰酶的比例为7:8），调节pH至7.5-7.7，在50 ℃下分别酶解4 h。酶解后煮沸灭酶，离心去除杂质，sevage法除蛋白两次，调节pH至7.0后加入无水乙醇至65%醇沉过夜，离心得沉淀，冷冻干燥后得糖胺聚糖粗制品，以Y/(×10-4)为指标。结果如图4所示，随着液料比的增大，Y值快速升高，当液料比为3:1时Y值达最大值，而后随着液料比的增大缓慢减小。故选取液料比为3:1。

图4 液料比对糖胺聚糖提取的影响

Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction yield of glycosaminoglycans

2.2.3加酶量对糖胺聚糖粗制品得率与含量的影响

取50 g合浦珠母贝全脏器匀浆后，分别按3:1的液料比加入150 mL蒸馏水55 ℃热水浸提5 h后，分别加入质量分数0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%的双酶（枯草杆菌中性蛋白酶与胰酶的比例为7:8），调节pH至7.5-7.7，在50 ℃下分别酶解4 h。酶解后煮沸灭酶，离心去除杂质，sevage法除蛋白两次，调节pH至7.0后加入无水乙醇至65%醇沉过夜，离心得沉淀，冷冻干燥后得糖胺聚糖粗制品，以Y/(×10-4)为指标。结果如图5所示，可知当加酶量为1.2%时Y值达最大值，而后随着加酶量的增大Y值减小。