分子生物学试题及答案3

核 酶 Ribozyme RNA 有酶活性的RNA 2．原核生物与真核生物启动子的主要差别？ 原核生物

TTGACA --- TATAAT------起始位点 -35 -10 真核生物

增强子---GC ---CAAT----TATAA—5mGpp—起始位点 -110 -70 -25

3．对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？

天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：

a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。 b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。 d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。

e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 4．举例说明差示筛选组织特异cDNA的方法？

制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。 例如：在肿瘤发生和发展过程中，肿瘤细胞会呈现与正常细胞表达水平不同的mRNA，因此，可以通过差示杂交筛选出与肿瘤相关的基因。也可利用诱导的方法，筛选出诱导表达的基因。

5．杂交瘤细胞系的产生与筛选？

脾B细胞+骨髓瘤细胞，加聚乙二醇（PEG）促进细胞融合，HAT培养基中培养（内含次黄嘌呤、氨基蝶呤、T）生长出来的脾B-骨髓瘤融合细胞继续扩大培养。 细胞融合物中包含：

脾-脾融合细胞：不能生长，脾细胞不能体外培养。

骨-骨融合细胞：不能利用次黄嘌呤，但可通过第二途 径利用叶酸还原酶合成嘌呤。氨基蝶呤对叶酸还原酶有抑制作用，因此不能生长。

骨-脾融合细胞：在HAT中能生长，脾细胞可以利用次黄嘌呤，骨细胞提供细胞分裂功能。

6、利用双脱氧末端终止法（Sanger法）测定DNA一级结构的原理与方法？ 原理是采用核苷酸链终止剂—2，，3，-双脱氧核苷酸终止DNA的延长。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。

方法是分成四组分别为ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA序列。 7、激活蛋白（CAP）对转录的正调控作用？

环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶难以与其结合。

CAP的存在（功能）：能显著提高酶与启动子结合常数。主要表现以下二方面： ①CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。

②CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。

8、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？

a、提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。 b、将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转

化。

c、对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。 d、对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。

9、基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。

抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针

多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。 在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。 如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。 10、说明通过胚胎干细胞获得转基因动物的基本过程？

胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：是胚胎发育期的胚细胞，可以人工培养增殖并具有分化成其它类型细胞的功能。 ES细胞的培养：

分离胚泡的内层细胞团进行培养。ES在无饲养层中培养时会分化为肌细胞、N细胞等多种功能细胞，在含有成纤维细胞中培养时ES将保持分化功能。

可以对ES进行基因操作，不影响它的分化功能可以定点整合，解决了随机整合的问题。向胚胎干细胞导入外源基因，然后植入到待孕雌鼠子宫，发育成幼鼠，杂交获得纯合鼠。