蛋白相互作用Pull-Down实验

12、洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。

13、阴性对照为结合蛋白溶液加入Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，

注意事项：

1、所有过柱的液体都要经过0.45um或0.22um的滤膜。 2、平衡柱子：

2.1 用3-5个柱体积蒸馏水洗柱

2.2 用3-5个柱体积的binding buffer平衡柱子。 3、洗柱：

如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质 3.1 除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸胍洗柱子，然后用5个柱体积的PBS洗柱

3.2 除去疏水性物质，用3-4个柱体积的70%乙醇或2个柱体积的含1%Triton X-100的PBS洗柱，然后用5个柱体积的PBS洗柱 4、柱子的保存

用3-5个柱体积的超纯水洗柱后，用3-5个柱体积20%的乙醇洗柱后将柱子保存于4℃冰箱

5、Ni离子柱的洗柱程序和柱子的保存同带His标签融合蛋白纯化的步骤。

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