L-肉毒碱联合前列舒通治疗ASAB阳性雄鼠的实验研究

【摘 要】 目的:观察l-肉毒碱联合前列舒通对asab阳性雄性小鼠的治疗效果。方法：用同种精子及福氏佐剂免疫昆明种雄性小鼠，采用酶联免疫吸附测定法（elisa）验证制得asab阳性动物模型即动物模型组，同时设立空白对照组。动物模型组分别给予l-肉毒碱加前列舒通、l-肉毒碱、前列舒通、强的松、生理盐水，灌胃四周。通过酶标仪测定光密度值(optical density,od值)观察药物治疗对血清asab的影响；通过伟力全自动电脑精子质量分析仪测定精子密度、活率及直线运动速度，并进行统计分析。结果：治疗后od值测定比较：联合治疗组、l-肉毒碱组、前列舒通组、强的松组od值均低于生理盐水组，差别有统计学意义（p＜0.05）；l-肉毒碱组od值高于联合治疗组、前列舒通组及强的松组，差别有统计学意义（p＜0.05）；联合治疗组od值虽低于前列舒通组和强的松组，但尚不能认为其差别有统计学意义（p＞0.05）；前列舒通组和强的松组相比差别无统计学意义（p＞0.05）。精子参数测定显示：l-肉毒碱组与前列舒通联合治疗组的精子各项参数要优于l-肉毒碱组、前列舒通组、强的松组及生理盐水组，差别有统计学意义（p＜0.05），但与空白对照组比较差别无统计学意义（p＞0.05）；动物模型组中四个治疗组精子相关参数与生理盐水组比较均有不同程度的改善，差别有统计学意义（p＜0.05）； l-肉毒碱组和前列舒通组分别与强的松组相比较其精子参数要好于强的松组，差别有统计学意义（p＜0.05）；前列舒通组精子参数要好于l-肉毒碱组，但无统计学意义（p＞0.05）；生理盐水组精子参数三项均低于空白对照组，差别有统计学意义（p＜0.05）。结论：asab不仅影响精子各项参数，还可能通过其它途径降低雄性小鼠的生育力；l-肉毒碱联合前列舒通治疗asab阳性雄性小鼠有确切的疗效，为治疗男性免疫性不育提供了一种新方法及翔实、可靠的实验依据。

【关键词】 asab阳性; 抗精子抗体； 雄性小鼠

experiment study on l-carnitine plus qianlieshutong in treating asab positive male mice

gao guo， xu jixiu， liu lei， guo qiang

department of urology, the first affiliated hospital of shanxi medical university.taiyuan 030001, china

男性不育是一个重要的全球性健康问题[１]。国外统计，男性不育患者中约有20%~40%是由免疫原因引起[2]。国内有人测定，显示男性不育症患者抗精子抗体（asab）阳性率为29.7%[3]。

精子和精浆中的多种成分均有抗原性，其中精子的抗原更是研究的重点。男性asab阳性是由于泌尿生殖道感染、理化损伤等多种因素造成血睾屏障破坏、精浆免疫抑制物（spim）功能低下，多种精子膜蛋白作为抗原刺激机体产生asab的一种自身免疫性疾病[4]。目前治疗男子asab阳性主要应用肾上腺糖皮质激素抑制自身免疫反应，从而达到治疗的目的，不仅副作用大，而且效果并不理想[5]。

本研究使用西药l-肉毒碱联合中药前列舒通治疗雄性asab阳性小鼠，通过检测血清asab的od值及精子形态学等指标来验证其疗效，从而进一步探讨asab致男子不育的机制，并为临床诊断、治疗男性免疫性不育提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

取10周龄昆明种雄性成年小鼠90只，体重25~30g，由山西医科大学动物实验中心提供。

饲养环境：空调控制室温20℃左右，相对湿度55±10%，照明/黑暗12/12h，摄食及饮水，自由摄取。其中30只用于小鼠精子的提取，60只用于制作动物模型。药品：l-肉毒碱由苏州第四制药厂提供，前列舒通生药由步长药业提供，强的松5mg/片由天津力生制药厂生产。 1.2 方 法

采用颈椎脱臼法处死30只10周龄雄性小鼠并取其附睾组织，置于生理盐水中剪碎，36℃孵育15min，使精子充分游离，pbs洗涤3次，调节精子密度至20×106 /ml左右。随机选取50只成年雄性小鼠，用该精子配等量的fruend完全佐剂制成精子悬液，每只0.3ml腹腔注射，免疫50只雄性小鼠，1周后再注射精子及fruend不完全佐剂悬液0.3ml，第3周注射等量精子；空白对照组小鼠10只同时给予腹腔注射等量生理盐水。

elisa法验证：制得抗精子抗体介导的asab阳性动物模型[6]。分组：50只小鼠随机分为5组，每组10只并随机编号；a组：l-肉毒碱与前列舒通联合治疗组，b组：l-肉毒碱治疗组，c组：前列舒通治疗组，d组：强的松治疗组，e组：生理盐水组，f组：空白对照组10只随机编号。

每日上午分别给予各组小鼠相应药物灌胃，连续4周：a组按照l-肉毒碱100mg/kg/d[7]加前列舒通生药2.0g/kg/d给予灌胃；b组按照100mg/kg/d给予相应剂量l-肉毒碱灌胃；c组按照前列舒通生药2.0g/kg/d灌胃；d组给予强的松10mg/kg/d灌胃[6]；e组和f组给予生理盐水0.4ml灌胃。

4周后，眼眶采血法取各组小鼠血0.4ml，2000/min离心3min后分离血清，elisa法检测血清asab并测定od值。

处死各组小鼠，取其附睾组织分别置于0.3ml生理盐水中剪碎，36℃下孵育15min，使精子充分游离，取一滴精子悬液涂于专用计数板上，伟力全自动精子分析仪观察并记录各小鼠的精子密度、活率及直线运动速度等参数。

2 统计分析

采用spss13.0统计软件包进行统计处理。其中，数据采用均数±标准差表示，多个均数间的两两比较使用lsd法（least-significat difference最小显著差值法）；od值的比较采用对数值变量变换法，精子活率的比较使用平方根反正弦变换法；检验水准为0.05。

3 结果

3.1 经治疗4周，由于操作方法不当或其它原因导致各组动物不同程度的死亡。见表1。

动物模型组小鼠经elisa法检测asab均为阳性，空白对照组经elisa法检测asab均为阴性。经lsd法比较：联合治疗组、l-肉毒碱组、前列舒通组、强的松组od值均低于生理盐水组，差别有统计学意义（p＜0.05）；l-肉毒碱组od值高于联合治疗组、前列舒通组及强的松组，差别有统计学意义（p＜0.05）；联合治疗组od值虽低于前列舒通组和强的松组，但尚不能认为其差别有统计学意义（p＞0.05）；前列舒通组和强的松组相比差别无统计学意义（p＞0.05）。

3.2 药物治疗对精子参数的影响

由表2分析：联合治疗组的精子各项参数要优于其它治疗组，差别有统计学意义（p＜0.05），但与空白对照组比较差别无统计学意义（p＞0.05）；动物模型组中四个治疗组精子相关参数与生理盐水组比较均有不同程度的改善，差别有统计学意义（p＜0.05）； l-肉毒碱组

和前列舒通组分别与强的松组相比较其精子参数要好于强的松组，差别有统计学意义（p＜0.05）；前列舒通组精子参数要好于l-肉毒碱组，但无统计学意义（p＞0.05）；生理盐水组精子参数低于空白对照组，差别有统计学意义（p＜0.05）。

4 结论

本实验通过人工主动免疫昆明种小鼠制作asab阳性动物模型，观察其精液参数，发现抗精子抗体阳性小鼠精子密度、运动速度、活率都有下降。

本研究通过使用l-肉毒碱联合中药前列舒通治疗雄性asab阳性小鼠，结果显示l-肉毒碱联合前列舒通在抗精子抗体转阴、精子参数等指标测定皆优于其它各组。l-肉毒碱组对血清asab的od值的影响要小于强的松组，但对精子各项参数的改善要优于强的松组，说明asab对asab阳性的影响机制不仅仅影响精子的各项参数，也通过其它途径对受孕产生影响。 l-肉毒碱联合前列舒通治疗asab阳性雄性小鼠有确切的疗效，为治疗男性免疫性不育提供了一种新方法及翔实、可靠的实验依据。

5 讨论

asab对精子的影响机制尚不完全明确，目前认为主要是通过对精子的细胞毒作用杀伤精子和asab与精子相关抗原结合影响精子的受精过程这两种机制影响精子的质量及功能，也可能通过攻击精子和睾丸生精微环境，从而造成精子生成障碍、精子功能障碍以及影响精卵融合等导致男性不育[9]。

人体内ｌ-肉碱90%以上存在于骨骼肌、心肌以及附睾中，其中附睾为人体含肉碱最高的器官，附睾尾部的附睾液中l-肉碱浓度更是比血浆中高数百倍[10]。在男性和雄性动物的生殖道中，其以游离ｌ-肉碱和乙酰ｌ-肉碱存在。研究表明,脂类氧化是精子获得能量的一种重要来源，附睾精子主要依靠长链脂肪酸和磷酯等物质在线粒体内β- 氧化供能, 但脂肪酸不能直接透过线粒体内膜, 必须由l-肉碱转运[11-12]。高浓度的l - 肉碱保证了精子的代谢和成熟过程中对能量的需求，直接影响着精子的运动、成熟和代谢过程[13-15]，实验证明诱导精子出现运动能力的地点与附睾上皮活跃转运肉碱的地点一致，提示肉碱与精子运动的诱导有关[16]。

祖国医学认为肾藏精，主生殖；认为本病病机实质是肾虚、湿热、瘀血。前列舒通是一种中成药，由川芎、土茯苓、三棱、泽泻、马齿苋等成分组成，具有清热利湿，化瘀散结之效，临床上用于的慢性前列腺炎、前列腺增生属湿热瘀阻证，证见尿频、尿急、尿淋沥，会阴、下腹或腰骶部坠胀或疼痛，阴囊潮湿等。方中川芎、三棱属于活血化瘀药物，配伍应用后可增强活血行气、通经止痛的作用，因此擅长散瘀通滞，对于淋症兼有瘀血之证尤为适合；泽泻其性凉、味甘可清湿热，故在本方中用以清淋症之湿热；方中加用土茯苓、马齿苋可清热解毒、抗炎等，与活血化瘀通用可增强活血行气的作用。前列舒通以清热利湿，活血化瘀为法进行组方，全方配伍精当，标本兼顾，充分体现了遣方组药的灵活性。

肾上腺糖皮质激素既具有抗炎作用，又能影响抗体的合成，抑制抗精子抗体和补体介导的细胞毒作用，进而保护精子。然而强的松的免疫抑制效应无特异性，既抑制异常的免疫反应，也能抑制正常的免疫反应，因而其虽能明显降低血清和精浆中的asab，但对于asab阳性的总体疗效不高[17]，且疗程长，一般需6~12个月。大剂量的强的松长期服用容易产生严重的副反应，如消化道溃疡、痤疮、向心性肥胖等，这就限制了强的松在治疗asab阳性中的应用。

现代药理学研究也证实中药具有很好的免疫调节作用，活血化瘀、清热解毒类药物多数

具有免疫抑制作用，能抑制非特异性免疫损伤，减轻组织病理损伤[18]。本实验中利用l-肉毒碱联合中药前列舒通治疗asab阳性雄鼠，其作用机理可能是利用前列舒通的活血化瘀抗炎、调节免疫等功能，配合l-肉毒碱的能量调节取得了较好的疗效，为临床治疗男性asab阳性提供了详实、可靠的实验依据。

但由于asab对生育的影响取决于其抗体的量、抗体的类型、抗体免疫球蛋白分子与精子特殊部位的亲和力，以及有关抗体在生育中所起的作用，而且可能通过多种途径对受孕产生影响，治疗也与患者个人体质有很大关系，所以其治疗机制还需进一步研究。