生化工程复习题（2013.下）

面的水化层和双电层，降低分子间斥力，加强了蛋白质分子间的疏水相互作用，使得蛋白质分子得以聚集成团沉淀下来。

33.简述凝胶色谱的分离原理？

答：凝胶排阻色谱的分离介质（填料）具有均匀的网格结构，其分离原理是具有不同分子量的溶质分子，在流经柱床是，由于大分子难以进入凝胶内部，而从凝胶颗粒之间流出，保留时间短；而小分子溶质可以进入凝胶内部，由于凝胶多孔结构的阻滞作用，流经体积变大，保留时间延长。这样，分子量不同的溶质分子得以分离。

34.何谓免疫亲和层析，简述亲和免疫层析介质的制备过程?

答、免疫亲和层析是利用亲和技术和色谱分离集成产生的一种高效色谱分离技术，其分离原理是通过抗原-抗体之间特异性的相互作用，从而实现高效的分离。层析介质的制备过程包括：抗体的制备、抗体提取、载体活化，手臂链的连接、抗体的连接等步骤。 35.何谓亲和吸附，有何特点？

答：亲和吸附是吸附单元操作的一种，它是利用亲和吸附剂与目标物之间的特殊的化学作用实现的高效分离手段。亲和吸附剂的组成包括：惰性载体、手臂链、特异性亲和配基。亲和吸附的特点是高效、简便、适用范围广、分离速度快、条件温和，但载体制备难度大，通用性差，成本较高。 36.简述有机溶剂沉析的原理？

答：1、概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 2、原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

37. 盐析的原理及影响因素？

1、亲水性大于蛋白质破坏水化层2、带电离子中和蛋白质表面电荷 影响因素：（1）盐离子浓度（2）生物分子种类（3）生物分子浓度（4） pH值（五）温度 38. 影响有机溶剂沉析的因素？

（1）温度（2）生物样品的浓度（3）pH（4）离子强度（5）金属离子

39. 等电点沉析注意事项？（1）等电点的改变（2）目的物的稳定性（3） 盐溶作用（4）pH的调节 40. 交换容量及其影响因素？

交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。影响交换容量的因素很多，主要可以分为两个方面，一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等影响。另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。 41. 疏水柱层析分离原理？

亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团。尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。 42. 气相色谱的条件选择？

1、固定相的选择2、载气流速的选择3、柱温的选择4、进样量与进样时间的影响5、色谱柱形、柱内径及柱长的选择

43. 影响电泳分离的主要因素？

1、大分子的性质2、电场强度3、溶液的pH 4、溶液的离子强度5、 电渗6、温度7、支持物的影响 44. 试列举常见的吸附剂。 （1）活性炭（2）白陶土（白土、陶土、高岭土）（3）磷酸钙凝胶（4）氢氧化铝凝胶（5）氧化铝（6）

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硅胶（7）滑石粉（8）硅藻土（9）皂土（10）沸石（11）聚酰胺粉（12）大网格聚合物吸附剂

45. 吸附色谱分离化学成分的原理是什么？简述硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭这四种吸附剂的主要用途和特点？

利用混合物中各成分在两相中吸附力的差异进行分离。硅胶可分离各类成分。氧化铝分离碱性或亲脂性成分。活性炭分离水溶性成分。聚酰胺是氢键吸附，适合分离黄酮成分。 46. 试列举改变透析袋孔径大小的方法？

（1）用64%氯化锌溶液处理15分钟，可使膜孔径增大，使大分子也能通过膜孔。（2）纤维素膜用27%乙酸吡啶溶液处理，会使孔径减小。（3）将透析袋内盛满水，在两端进行拉伸，会使透析袋变薄，加快透析速率；如果不向袋内注入水而充满空气在两端拉伸，膜的孔径会变小，使有些溶质不能透过膜。 47. 简述生物活性物质分离纯化的主要原理？

答： 生物大分子分离纯化的主要原理是：1）根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心与超离心、膜分离、凝胶过滤等；2）根据分子电离性质（带电性）差异进行分离，如离子交换法、电泳法、等电聚焦法；3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀及有机溶剂分级沉淀等；4）根据物质吸附性质的不同进行分离，如选择性吸附与吸附层析等；5）根据配体特异性进行分离，如亲和层析法等。 48. 树脂的再生（或称活化）？

所谓树脂的再生就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程，树脂的再生反应是交换吸附的逆反应。再生方法可根据污染情况和条件而定，一般阳树脂在软化中易受Fe3+污染，清除铁化合物的方法，通常是用加抑制剂的高浓度盐酸（10%～15%）浸泡树脂5～12h，甚至更长。也可用柠檬酸、氨基三乙酸、EDTA等络合物进行处理。阴树脂易受有机物污染，可用10%NaCl+2%～5%NaOH混合溶液浸泡或淋洗 49. 简述凝胶层析有哪些用途？

①作为分析工具；作为脱盐工具②生物大分子的浓缩③除热原物质④生物大分子的分离纯化；分子量的测定

50. 蛋白质的纯度鉴定的方法有哪些。

(1)色谱法用分子筛或离子交换色谱检查样品时，如果样品是纯的，应显不单一的洗脱峰。该样品在色谱性质上是均一的，称为“色谱纯”。(2)电泳法用PAGE检查样品呈现单一区带，也是纯度的一个指标，这表明样品在电荷和质量方面的均一性。可以说纯的蛋白质电泳仅有一条区带，但仅有一条区带却不一定是纯的，仅能表明它在电泳上的均一性，称为“电泳纯”。(3)免疫化学法 免疫学技术是鉴定蛋白质纯度的有效方法，它根据抗原与抗体反应的特异性，可用已知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体。用此法检测的纯度称为“免疫纯”。

51. 根据溶解度不同，蛋白质有几种分离纯化方法。

利用蛋白质溶解度的差异是分离蛋白质的常用方法之一。影响蛋白质溶解度的主要因素有溶液的pH值、离子强度、溶剂的介电常数和温度等。 1)等电点沉淀蛋白质在等电点时溶解度最小。单纯使用此法不易使蛋白质沉淀完全，常与其他方法配合使用。2)盐析沉淀 中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著的影响。一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。盐析沉淀的蛋白质一般保持着天然构象而不变性。有时不同的盐浓度可有效地使蛋白质分级沉淀。通常单价离子的中性盐(NaCl)比二价离子的中性盐[(NH4)2SO4]对蛋白质溶解度的影响要小。3)低温有机溶剂沉淀法在一定量的有机溶剂中，蛋白质分子间极性基团的静电引力增加，而水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀。此法沉淀蛋白质的选择性较高，且不需脱盐，但温度高时可引起蛋白质变性，故应注意低温条件。一般在0～40℃之间，多数球状蛋白的溶解度随温度的升高而增加；40～50℃以上，多数蛋白质不稳定，并开始变性。因此对蛋白质的沉淀一般要求低温条件。

52．进行细胞破碎的方法有哪些：①机械破碎法：是通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法。②物理破碎法：用各种物理因素(温度、压力、超声波)的作用使细胞破碎的方法。③化学破碎法：用化学试剂可使细胞膜结构改变或破坏，改变细胞膜的通透性。④酶学破碎法：通过加入酶或利用细胞本身

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的酶的作用，使细胞破碎的方法。

53．蛋白质和酶提取、分离的一般原则：①提取、分离方法条件要温和使目的蛋白质和酶的活性和功能不受损害②尽量尽早除去各种杂质、脂类、核酸及毒素。③设法除去变性的和不需要的蛋白质。④设法提高目的蛋白质的含量或生物活性。⑤分离纯化要在缓冲溶液中进行。⑥建立灵敏、特异、精确的检测方法。⑦根据其存在的部位、分子结构及溶解性质的不同选择不同的提取方法。

54．实验室进行蛋白质盐析沉淀时应用最多、最广的是硫酸铵，它的优缺点是什么：优点：①它在水中溶解度大；②其溶解度受温度的影响较小；③价廉易得；④不易引起蛋白质变性；⑤分离效果比其它盐好。缺点：①缓冲能力差；②NH4+离子会干扰蛋白氮的测定。

55．核酸提取要注意的原则：①防止核酸酶的降解: 在提取分离核酸时要降低核酸酶的活性，通常加入抑制剂和去激活剂。②防止化学因素的降解: 避免强酸强碱。③防止物理因素的降解: 核酸大分子、高温、机械作用等均可以破坏核酸分子的完整性，因此核酸提取适于在低温及避免剧烈搅拌等条件下进行。 56. 选择吸附剂时应注意的问题：

①吸附剂应有适当的吸附力和尽量大的表面积；②对被分离物有足够的分辨率，对不同物质的吸附力不同；③对被吸附物的吸附应是可逆的，一定条件下可解吸、洗脱；④不溶于所用的溶剂中，不引起被吸附物化学变化；⑤颗粒均匀，操作时稳定，不会破裂。 57. 选择洗脱剂时应注意的问题：

①不与吸附剂起化学反应，且不使吸附剂溶解；②对样品的各组分溶解度大、粘度小、流动性好；③不与各组分起化学反应，且易与被洗脱组分分开；④纯度高，无杂质影响。

58. 纸层析时对滤纸的选择有何要求：滤纸的厚薄程度、纤维的松紧度不同，使与滤纸纤维结合的水量不一样，两相的体积比也不同。得到的Rf 值也不相同。滤纸中的杂质也会影响Rf 值。因此，层析时对滤纸的要求较高：由高纯度的棉花制成，质地均一、厚薄一致、纤维松紧度适中、有一定的机械强度。 59. 在纸层析前，滤纸和层析装置为什么要先用层析溶剂平衡：层析前滤纸与层析装置用溶剂系统的蒸气饱和。不平衡时滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组成发生改变，导致溶剂前沿不齐，影响层析效果和Rｆ值。

60. 担体应具备哪些条件：①表面积大；②孔径分布较均匀；③表面无催化或吸附性能；④与固定液或被分析的物质不起化学反应；⑤热稳定性好；⑥有较好的机械强度。

61. 离子交换剂选择时应考虑哪些因素：①样品离子带何种电荷 阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阳离子只能被阳离子交换剂吸附；②离子的浓度 浓度大时，选择交换容量大的交换剂型号③被分离物质相对分子量的大小 分子量大时要求交联度低，分子量小时选择较高交联度更好；④离子与交换剂亲和力的大小 选择不同型号的交换剂，既要考虑吸附，还要考虑便于洗脱；⑤样品物质及交换树脂的物理化学特性 根据其对酸、碱、温度的敏感情况，控制好环境条件。 62. 试述聚丙烯酰胺凝胶具有哪些的优点：（１）在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

63. 等电聚集电泳具有哪些优缺点：优点： ⑴分辨率高；⑵随电泳时间增加区带越来越窄；⑶样品加在任何部位都可以聚焦到等电点pH位置；⑷很稀的样品都可分离，且重现性好；⑸可用于测定多肽或蛋白质的等电点。缺点：①要求使用无盐溶液，但某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，易产生沉淀。②对一些在pI不溶解或发生变性的蛋白质不适用。

64. 对载体两性电解质有什么要求：①在pI处必须有足够的缓冲能力，以便控制pH梯度。②在pI处必须有足够的电导，以便使一定电流通过。而且，各不同pI值的载体有相同的电导系数，使整个体系中电导均匀，获得均匀的电场。③相对分子质量要小，以便在聚焦后能容易地和蛋白质组分分开。④化学组

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分不同于被分离物质，以免干扰测定。⑤不与被分离物质起化学反应，也不会引起被分离物质变化。 65. 在生化领域中，应用荧光检测的方法在哪些：在生化领域中，应用荧光检测的方法分三类：①直接用荧光性物质检测②利用非荧光性物质与荧光试剂反应，生成荧光性物质③在荧光性物质溶液中加入消光物质。

四、问答题

1.一种植物叶中得到了粗细胞提取液，每毫升含蛋白质32mg，在提取条件下，10μl提取液的催化反应速度为0.14μmol/min,取50μl提取液用硫酸铵盐析分离，将饱和度0.3-0.6的沉淀再溶于10ml水中，此溶液的蛋白浓度为50mg/ml，从中取出10μl，测定其反应速度为0.65μmol/min,计算:

a) 提取过程中酶的回收百分率

b) 酶的提纯倍数 c) 2、离子交换层析的洗脱方式可分为哪几种？ 答：三种。

（1）简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数差异较大。

（2）分步洗脱：按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。

（3）梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、离子强度、极性或pH值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中 ，亦即离子强度梯度。 2.聚焦层析原理

聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 （1） pH梯度溶液的形成

在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度自动形成。先用起始缓冲液平衡到pH9,再用含pH6的多缓冲剂物质的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换剂结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。照此处理一段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6一9的梯度。聚焦层析柱中的但是随着淋洗的进行梯度择臼夜是在淋洗过程中自动形成的恒定于此值，这时层析的梯度也就消失了。

（2）蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点和层析柱的PH值。洗脱剂向前移动，固定相中的PH值随时间的变化而变化。当蛋白质移动至环境PH值高与PI值时，蛋白质带负电荷，与阴离子交换剂结合。蛋白质周围环境PH值低于PI值时带正电荷，被解吸下来。从而蛋白质按等电点大小被洗下来。 （3）聚焦效应

蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。蛋白质加到已形成PH提督的层析柱时，由于洗脱液的连续流动，他迅速的移动到与等电点相同的PH值处。从此位置开始，蛋白质将缓慢的速度进行吸附，解吸附，直到PH,

答：提高分辨率的选择包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长的层析柱，减少加样量，降低洗脱速度等。各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。 4.简述等电聚焦法的基本原理？

答：这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称为等电聚焦（Isoelectric focusing）。等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差pH 0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。等电

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