生化工程复习题（2013.下）

度凝胶电泳。

128.PAGE据电泳装置不同分为垂直的圆盘及板状两种。

129.毛细管电泳中的样品各组分，不管是否带有电荷或带何种电荷，都会从正极向负极移动，迁移速率正离子最大，负离子最小，中性分子_居中。

130.常用的电泳染色法有考马斯亮蓝染色法和银染色法，其中银染色法灵敏度高，考马斯亮 蓝染色法线性宽。

131.固定化酶的细胞或原生质制备方法有： 、 、 和 。吸附法、包埋法、共价结合（偶联）法和交联法。

三、简答题

1、选择制备生命大分子的材料应遵循的原则是什么?

答：材料选择应遵循的原则是——有效成分含量高，来源丰富，稳定性好，保持新鲜；提取工艺简单；有综合利用价值。在实践过程中则需抓住主要矛盾，全面考虑，综合权衡。 2、一般理想的提取溶液应具备下述条件？

答：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。 3、吸附层析有什么优点？

答：吸附层析是应用最早的层析方法，吸附剂来源丰富、价格低廉、易再生，装置简单、灵活，又具有一定的分辨率等优点，至今仍广泛应用于各种天然化合物和生物发酵产品等初级产品的分离制备，如尿激酶、绒毛膜促性腺激素等粗品的制备。 4、增加吸附剂表面积的方法有哪些？

答：增加吸附剂表面积的方法有：将吸附剂磨碎成小的颗粒；通过处理使颗粒表面凹凸多变；使吸附剂成为凝胶状态；将吸附剂制成具有大量微孔的颗粒。

5、与PAG圆盘电泳相比，PAG垂直板电泳有什么优越性？ 答：（1）表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。（2）在同一块胶板上可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影。（3）胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。（4）胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描。（5）可进行双向电泳。 6. 破碎生物细胞的常用方法有哪些？

答：机械法：研磨，高速捣碎机；物理法：反复冻溶，超声波破碎，压榨法，溶胀法；化学法：自溶，酶解法，有机溶剂处理。

7、有机物的色谱分析，如何确定是选用HPLC还是GC？

一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小（一般在200以下）、沸点较低时，加热又不易分解的样品，可用GC进行分析；当沸点较高(＞450℃)、不能气化或热稳定性差者，可用HPLC分析。相对分子质量在200-2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。

8.交变脉冲电场凝胶电泳原理和应用。

答：电泳系统是由一个水平式电泳槽和两组独立，彼此垂直的电极组成，一组电极负极为N，正极为S；另一组负极为W，正极为E。一块正方形琼脂糖凝胶板呈45°置于中央，电场在N-S和W-E之间交替建立。 电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大小有关。电泳时，DNA分子处在连续间隔交替的电场中。首先向S极移动，然后改向E极。在每次电场方向改变时，DNA分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。只有当DNA分子达到一定构型后，才能继续前进。DNA分子净移动方向与加样线垂直，使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万bp的大分子DNA。 9.试述聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶的不同之处？

（1）分离范围不同：琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子

9

量较小的物质，如蛋白质，多肽等。

（2）凝胶配置程序不同：琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前倒入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。

（3）凝胶的厚度不同：琼脂糖凝胶最薄只能达到３ｍｍ；聚丙烯酰胺凝胶可以制成０.２ｍｍ，分辨率高。 （4）安全性不同：琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶单体及交联剂有毒性。 10.离子交换层析的梯度洗脱，所用梯度溶液按组成来分，一般有哪两种？

答：一种是增加离子强度的梯度溶液。是用一简单的盐（如NaCl或KCl）溶解于稀缓冲液制成的，习惯上不用弱酸或弱碱的盐类；

一种是改变pH值的梯度溶液。该溶液是用两种不同pH值或不同缓冲容量的缓冲液制成的，所用缓冲液的种类、pH值以及缓冲容量要认真选择，否则将达不到预期目的。 11、HPLC（高效液相色谱）具有哪些特点？

答：高压：由于液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。

高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数十分钟。通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

高效：由于HPLC的柱效较高(以理论塔板数计大约7000～10000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

-9-11

高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10g乃至10g 的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。

12、在酶的纯化过程中，如果某一纯化步骤中酶活力超过了100%，可能的原因是什么？

答：在酶的纯化过程中，如果某一纯化步骤中酶活力超过了100%，则很有可能是由于此酶的激活剂（包括别构激活剂）的加入或抑制剂的丢失所造成的。这些激活剂或抑制剂可能原先并不知道。 13.简述影响抽提的决定因素及其原则

影响抽提的因子有——溶剂的浓度和极性，PH值，离子强度，水解酶，温度，搅拌，氧化，金属离子，抽提液和抽提物的比例。

14、选择分离纯化方法的依据和主要的要求是什么？如何评价分离纯化的可靠性？

答：依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。早期分离纯化要求：①要快速、粗放。②能较大地缩小体积。③分辨力不必太高。④负荷能力要大。晚期分离纯化要求：分辨力要高。分离纯化的可靠性可通过生物大分子制备物的均一性（即纯度）和活性的鉴定。纯度要高，最好是一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。活性回收率要高，酶比活力要高。 15、吸附剂的比表面积对吸附容量有什么影响？如何克服细颗粒吸附剂流速慢的问题？为什么？ 答：比表面积指每克吸附剂所具有的表面积。吸附现象发生在吸附剂的表面，因此吸附剂比表面积愈大，吸附量愈多。为克服细颗粒吸附剂流速慢的问题，可以在吸附剂总量不变的情况下，选择较大径高比的层析柱或/和增加操作压。增大层析柱直径会使层析柱有较大横截面，使流速加快，分辨率降低；压强增大，流速加快，层析分辨率提高（流速慢有扩散现象）。

16、在疏水作用层析纯化苯丙氨酸裂解酶时，为什么要用双梯度 [NH4SO41.0～0.0mol/L,甘油0～20%]Tris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱？

答：双梯度指硫酸铵浓度从大到小和甘油浓度从小到大。降低盐浓度，使洗脱液的离子强度降低，疏水层析时洗脱液的洗脱能力增大。增加甘油浓度，使洗脱液极性减小，疏水层析时洗脱液的洗脱能力增大。 17.下列五肽的混合物，上阴离子交换柱，以pH10到pH1连续变化的缓冲液洗脱，它们洗脱的次序是怎样的？为什么？

a. Lys-Gly-Ala-Thr；b. Lys-Gly-Ala-Glu；c. His-Gly-Ala-Glu； d. Glu-Gly-Ala-Glu；e. Val-Gly-Ala-Lys

答：阴离子交换树脂与带负电多的肽段结合牢固，后洗脱。带电相同的情况下，与疏水性较强的肽段结合

10

牢固。所以从由先到后的洗脱顺序是 a, e ,b ,c ,d。

18、为什么在凝胶过滤层析时，分子量小的蛋白质有较长的保留时间，而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它又跑得最快？

答：凝胶过滤常用的是葡聚糖凝胶(Sephadex)，这种凝胶颗粒的交联介质排阻分子量较大的蛋白质，仅允许分子量较小的蛋白质进入颗粒内部，所以分子量较大的蛋白质只能在凝胶颗粒之间的空隙中通过。这意味着它通过柱的体积为床体积减去凝胶颗粒本身所占的体积。而分子量小的蛋白质必须通过所有的床体积才能流出，所以，分子量小的蛋白质比分子量大的蛋白质有较长的保留时间。而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其凝胶介质并不存在象凝胶过滤中Sephadex那样的颗粒之间的空隙。所以，所有的蛋白质分子必须通过交链介质而移动。蛋白质的分子量越小，通过介质就越快，移动得越迅速。

19.一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。

答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质，余留7、下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。 20.凝胶过滤层析中的分子筛效应与SDS-PAGE中的分子筛效应有什么异同点？ 答：相同点：根据生物大分子的分子量大小进行分离。

不同点：二者作用机制不同，凝胶过滤层析主要依靠分子筛效应，即大分子物质经凝胶间隙被洗脱，而小分子物质由于进入了凝胶颗粒内部，洗脱时走的路径较长，故而在凝胶中能保留较长的时间，中等大小的分子由于进入凝胶颗粒的程度不同，按照分子量由大到小的顺序先后洗脱。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质所带电荷性质被SDS所掩盖，SDS-蛋白质复合物变成雪茄状，其短轴均相同，而长轴与分子量大小成正比，在电泳时，SDS-蛋白质复合物的迁移率与其形状有关，分子量小的迁移较快。 21、影响电泳时带电颗粒泳动度的主要因素有哪些？它们是分别如何影响的？ 答：（1）首先决定于带电颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则慢。 （2）电场强度。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。

（3）溶液的pH值。溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多；电泳速度越快；反之则越慢。

（4）溶液的离子强度。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。

（5）电渗作用。电渗是指在电场中液体对固体支持物的相对移动。在电场中，若带负电荷颗粒向正极移动，而介质却向阴极移动，从而对颗粒的泳动起阻碍作用；反之加快。

（6）支持物。对支持物的一般要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。支持物性质不同也会影响泳动速率，如琼脂与聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快，反之则慢。

22、某无四级结构的蛋白质用凝胶过滤法测定的表观分子量是90kD；用SDS-PAGE测定时，它的表观分子量是60kD，无论β-巯基乙醇是否存在。哪种测定方法更准确？为什么？

答：蛋白质的分子形状影响它在凝胶过滤时的行为。分子形状较长的蛋白质在凝胶过滤时具有类似于分子较大的蛋白的行为。用SDS-PAGE测定的蛋白质分子量应该是比较准确的，因为变形后的蛋白质的迁移速度只取决于它的分子大小。

23、请根据下面的信息确定蛋白质的亚基组成：① 用凝胶过滤测定，分子量是200kD；②用SDS-PAGE测定，分子量是100kD；③在β-巯基乙醇存在下用SDS-PAGE测定，分子量是40kD和60kD。

答：答：凝胶过滤法分离的蛋白质是处在未变性的状态，如果被测定的蛋白质的分子形状是相同的或者是相似的，所测定的分子量应该是较准确的。在没有β-巯基乙醇存在下，SDS-PAGE测定蛋白质的分子量只是根据它们的大小。但这种方法能破坏寡聚蛋白质亚基间的非共价作用力，使亚基解离。在这种情况下，所测定的是亚基的分子量。如果有β-巯基乙醇存在，则能破坏肽链内或肽链间的二硫键。在这种情况下

11

进行SDS-PAGE，所测定的分子量是亚基的分子量或者是肽链的分子量（如果亚基是由二硫键连接的几个肽链组成）。根据题中给出的信息，该蛋白质的分子量是200kD，由两个大小相同的亚基（100kD）组成，每个亚基由两条肽链（40kD和60kD）借二硫键连接而成。

24、离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子交换剂，何为阴离子交换剂？

答：离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基团以共价键连接，电荷基团与反离子以离子键结合。阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，电荷基团可以与溶液中带正电荷的化合物或阳离子进行交换反应。阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电。因此，电荷基团可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应。 25、当含有下列性质的蛋白质混合物：

①相对分子质量12000 PI=10 ②相对分子质量62000 PI=4

③相对分子质量28000 PI=7 ④相对分子质量9000 PI=5 若不考虑其他因素，问：

A.当它们流经DEAE-纤维素（阴离子交换纤维素）时，用线性盐浓度梯度洗脱时，这些蛋白质被洗脱的顺序如何？为什么？

B.当它们流经Sephadex G-50凝胶层析柱时，这些蛋白质被洗脱的顺序如何？为什么？

答：①③④②。当pH>pI时，被分离物带一定数量的阳离子，等电点越高，则其阳离子数越多，与阴离子交换树脂的结合越弱，故最先被洗脱。②③①④。相对分子质量越大，流经凝胶柱时洗脱体积小， 最先被洗脱。

26.在色谱操作过程中为什么要进行平衡？

答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。2、液体环境：为了保持被分离物质运动的均一性，以及好的吸附和解析效果，因此要保持孔隙内部和外部液体环境的一致，所以进行液体环境的平衡。

27．以羧酸吸附蛋白质为例，简要说明离子交换树脂的洗脱方法及其原理？

答：1、加碱：主要是调节蛋白质到达等电点，是蛋白质带电量减少，吸附力下降从而被洗脱下来。2、加酸：主要是抑制羧酸的电离，使活性基团带电量下降，吸附力下降从而蛋白质被洗脱下来。3、加盐：依照质量作用定律，把蛋白质洗脱下来。

28．在离子交换色谱操作中，怎样选择离子交换树脂？

答：1、对阴阳离子交换树脂的选择：正电荷选择阳离子交换树脂，负电荷选择阴离子交换树脂。2、对离子交换树脂强弱的选择：较强的酸性或碱性，选择选用弱酸性或弱碱性树脂。3、对离子交换树脂离子型的选择：根据分离的目的，弱酸或弱碱性树脂不使用H或OH型。 29．简述盐析的原理及产生的现象？

答：当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：（a）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；（b）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀； 30.简述吸附色谱分离技术的原理？

答: 利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离

31.怎样进行离子交换树脂的预处理及转型？

答：物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；化学处理：转型（氢型或钠型）阳离子树脂 酸—碱—酸，阴离子树脂 碱—酸—碱，最后以去离子水或缓冲液平衡 32.何谓等电点沉析法？

答:蛋白质再等电点下的溶解度最低，根据这一性质，再溶液中加入一定比例的有机溶剂，破坏蛋白质表

12