植物资源化学实验讲义131202

实验五 植物原料中总糖含量测定

一、糖含量标准曲线的绘制

准备一系列包含要量化的化合物的校准标准样，参照表1中的建议浓度范围。使用四点校准。如果标准的准备在建议范围以外，这些校准曲线的新范围必须验证。

表1 校准标准样的建议浓度范围

成分 D-纤维二糖 D（+）葡萄糖 D（+）木糖 D（+）半乳糖 D（+）阿拉伯糖 D（+）甘露糖 建议浓度范围（mg/mL） 0.1-0.4 0.1-0.4 0.1-0.4 0.1-0.4 0.1-0.4 0.1-0.4 不同浓度的糖标准溶液通过0.2微米膜的过滤器过滤后，将其装于自动进样小瓶中，并密封和标记。

使用线性回归，为每一个分析样创建一个校准曲线。通过这些曲线，用HPLC测定分析样中每个组分的浓度（mg/mL），如果需要，可通过其稀释倍数进行校正。

二、原料总糖含量的测定

1、将测定Klason木质素含量时所得的水解液大约20mL转入50mL的锥形瓶，用碳酸钙将每个样品中和至pH5~6，用pH试纸监测，防止中和导致pH超过6。当pH达到4时，缓慢添加碳酸钙，充分涡旋混匀样品。当pH达到5~6时，停止加入碳酸钙，将样品静置，取上清液。在静置后，pH值大约为7。（样品pH值绝不允许超过9 ，因为这将导致糖分的损失。）

2、通过0.2微米膜过滤到自动样品瓶，制备进行高效液相色谱分析的样品，密封并标记小瓶，中和后的样品可在冰箱中存放3或4天。可重复制备每个样品，保留一个重复样进行后续分析。在冷藏后，应检查样品是否存在沉淀物。如含有沉淀应再次进行过滤处理 ，通过0.2微米的过滤器，同时继续冷冻。 （如果样品浓度可能超出校准范围，则对样品进行必要的稀释，并记录稀释倍数。在运行完毕后，应对浓度进行还原纠正。）

3、高效液相色谱法分析校准标准样和样品时，使用Shodex糖SP0810或Biorad Aminex HPX - 87P柱，并配备适当的保护柱。 高效液相色谱条件：

注射量： 10--50μL，取决于浓度和检测器的灵敏度 流动相：高效液相色谱法级的水，即经0.2微米过滤和脱气 流量： 0.6mL/min

柱温： 80--85℃

检测器温度：尽可能接近柱温 检测器：折射率 运行时间： 35min

4、 检查试验样品存在纤维二糖和寡聚糖的色谱。纤维二糖含量大于3mg/mL表明了不完全水解。新鲜样品应当进行水解和分析。

5、 检查试验样品色谱是否存在纤维二糖之前的洗脱峰（如使用所建议的条件，则保留时间为4-5min）。这些峰可能表明在前面的样品中含有高水平的糖降解物，这表明了过分水解。所有显示过分水解的样品应该进行新鲜样品的水解和分析。

6、用HPLC测定分析样，根据各种糖校准曲线确定每个糖组分的浓度（mg/mL），根据稀释倍数计算水解液中各种糖的浓度。

7、从相应的单糖浓度计算多糖浓度，这是通过脱水校正，C-5（木糖和阿拉伯糖）为0.88（或132/150），C-6（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）为0.90（或162/180）

C多糖=C相应单糖*脱水校正因子

8、根据滤液体积，计算每种糖的含量。