脓汁和粪便标本中病原菌的检测

脓汁和粪便标本中病原菌的检测（作者：bibi）

目的 从脓汁和粪便标本中分离、培养和检测病原体。方法 培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定。结果 脓汁标本形成黄、白两种颜色菌落，均为革兰氏阳性菌，均对青霉素和链霉素敏感；粪便标本形成紫黑和粉红色两种菌落，均为革兰氏阴性菌，对青霉素不敏感，对链霉素敏感。四种细菌均对广谱抗菌素庆大霉素敏感。 关键词：脓汁 粪便 微生物 细菌 菌落 生化鉴定 药敏试验

引言：

常见的化脓性病原菌有葡萄球菌、链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、假单胞菌、流感杆菌等。浓汁标本在做细菌分离培养的同时，均须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽孢有无，为临床提供最初的诊治依据。

粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基（如SS、伊红美蓝平板、碱性蛋白胨水），尽可能抑制杂菌，以利于病原菌的检出。

这次实验我们从浓汁标本中检出的是金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌，从粪便标本中检出的是大肠埃希菌、痢疾志贺菌。

更重要的是我们了解了，医学微生物学主要的研究方法和手段，掌握了微生物试验的基本技能和基本原理，树立了牢固的无菌观念。 同时培养学生自学能力、科学思维能力、动手能力和表达能力。培养学生从临床标本中分离细菌以查找与疾病有关的病原体，为临床治疗预后调查提供一定的价值

1.实验器材：

接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯 CX21型 生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子

2.实验方法：

2.1培养基的制备、消毒和灭菌

培养基制备的一般程序：

① 调配→溶化→ 矫正pH →分装→灭菌→检定→保存。

② 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→检定→保存。

2.2细菌的分离与培养

2.2.1采用平板划线分离法，将取脓汁和粪便标本中混杂的多种细菌，分别在普通平板和伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养18～24h ，从而分离出单个菌落。

2.2.2细菌群体生长特征的观察。观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。

2.2.3细菌的纯培养。脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落；粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。挑选这四种不同菌落分别在斜面培养基上接种，标记，在37℃培养18h。

2.3细菌个体形态特征的观察

2.3.1取两块玻片，在每块玻片上加生理盐水3～4ul，2滴，在一块玻片上取黄色和紫黑菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成1cm2；在另一块玻片上取白色和粉红色菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成1cm2。经在空气中干燥后，再用酒精灯对其进行固定。

2.3.2革兰染色。用结晶紫对以上两块玻片进行初染1分钟，水洗；再用卢戈碘液媒染1分钟，水洗；然后用95％乙醇对其进行脱色约20秒钟，水洗；最后用稀释复红复染1分钟，水洗；吸干，在显微镜下镜检。

2.4细菌生化反应鉴定

2.4.1糖发酵试验 用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中，在37℃下，培养24小时，观察其产酸产气情况。

2.4.2细菌药物敏感性试验 接种环分别取黄、白、紫黑、粉红色四种菌液3～6ul×2环，各自在四个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养，观察结果。

2.4.3血浆凝固酶试验 取二滴兔血浆置于洁净的玻片上，分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。

2.4.4半固体接种法 接种针斜面取四种不同颜色的细菌，各自接种进四个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。 在37℃下,培养24小时，观察结果。

2.4.5 痢疾血清玻片凝集反应 取载玻片1张，滴加痢疾血清和生理盐水各15ul，2滴。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落，各自与上述混合液液滴混匀，观察结果。

3.实验结果：

3.1脓汁和粪便中的细菌在普通琼脂平板和伊红美蓝平板上的菌落特征

结果显示：脓汁标本在普通培养基上形成白色和黄色两种菌落；粪便标本在伊红美蓝培养基上形成紫黑色和粉红色两种菌落

图一 脓汁标本在普通培养基上的生长情况 图二 粪便标本在伊红美蓝培养基上的生长情况

3.2经革兰氏染色后在显微镜下的形体特征

玻片一：黄色的细菌在显微镜下呈球形，呈葡萄串状排列，紫色，说明为革兰氏阳性菌；紫黑色的细菌呈杆状，粉红色，说明为革兰氏阴性菌。

玻片二：白色的细菌在显微镜下呈球形，呈链状排列，紫色，说明为革兰氏阳性菌；粉红色的细菌呈短杆状，粉红色，说明为革兰氏阴性菌。

图三 黄色细菌在显微镜下的形态 图四 紫黑色细菌在显微镜下的形态

图五 白色细菌在显微镜下的形态 图六 粉红色细菌在显微镜下的形态 3.3糖发酵试验的结果

4.3.1紫黑色细菌在葡萄糖和乳糖发酵罐中皆变色和产生气泡，说明紫黑色细菌均能分解葡萄糖和乳糖，产酸产气。

4.3.2粉红色细菌在葡萄糖发酵管中变色但不产生气泡，说明其能分解葡萄糖，产酸不产气；在乳糖发酵罐中既不变色又不产生气泡，说明其不能分解乳糖，不产酸不产气。

3.4药敏实验结果分析

3.4.1黄色细菌和白色细菌均在青霉素、链霉素和庆大霉素纸片均出现抑菌圈，其中在青霉素的抑菌圈的直径均为30mm，≥29mm，说明两者均对对青霉素敏感；在链霉素的抑菌圈的直径为13.5mm和13mm，在12～14mm之间，说明均对链霉素中度敏感；在庆大霉素的抑菌圈的直径均为17mm，≥15mm，说明均对庆大霉素敏感。

3.4.2紫黑色细菌和粉红色细菌在青霉素均不出现抑菌圈，说明两者均对青霉素耐药；在链霉素出现抑菌圈，其直径为分别为15mm和16mm，≥15mm，说明两者均对对链霉素敏感；在庆大霉素均出现抑菌圈，抑菌圈的直径分别为17mm和18mm，≥15mm，说明两者均对庆大霉素敏感。 表二 药敏实验结果分析 黄色细菌 白色细菌 紫黑细菌 粉红细菌 青霉素 + + - - 链霉素 + + + + 庆大霉素 + + + + 注：耐药－，中度敏感±，敏感＋ .

3.5 血浆凝固酶试验的结果分析

观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明其为凝固酶阳性，是致病菌；白色菌落细菌不出现凝集反应，说明其为凝固酶阴性，不是致病菌

3.6紫黑色和粉红色细菌在半固体培养基中的结果

3.6.1紫黑色细菌在半固体培养基内呈扩散生长,培基混浊，说明该细菌有鞭毛；

3.6.2粉红色细菌在半固体培养基内沿接种线生长,培基清澈透明，说明该细菌无鞭毛。

表一 紫黑色和粉红色细菌生化反应结果分析 紫黑细菌 葡萄糖 ? 乳糖 ? 半固体 + 葡萄糖 + 粉红色细菌 乳糖 - 半固体 - 3.7痢疾血清玻片凝集反应的结果分析 观察到紫黑色菌落的细菌不能使痢疾血清产生颗粒性物质，说明其不是引起痢疾的致病菌；粉红色菌落的细菌使痢疾血清产生颗粒性物质，说明其是引起痢疾的致病菌。

4.结果讨论

在制备好培养基后，我们首先采用的是平板划线分离法，从不同的样本中分离出不同的细菌。从浓汁标本中分离出黄色和白色两种菌落，在显微镜下观察时，这两种细菌均为G﹢球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌；再结合菌落的颜色，可以初步断定，这是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。再通过血浆凝固酶试验，观察到金黄色葡萄球菌能使血浆产生颗粒性物质，而白色葡萄球菌则没有任何反应，说明了金黄色葡萄球菌是致病菌。最后进行的是药敏试验，从培养基上可以观察到，不同的抗生素所形成的抑菌圈不同，其中青霉素对金黄色葡萄球菌最敏感。

用伊红美蓝平板分离菌落时，可以从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落；在显微镜下观察时，这两种菌均为G﹣杆菌，排列不规则，从形态上不能鉴别是什么细菌；经糖发酵试验，可以观察到，紫黑色的细菌使能使葡萄糖和乳糖的试管变色和产生气体，粉红色的细菌只能使葡萄糖的试管变色而无气体，对乳糖无反应；经半固体动力试验，观察到紫黑色的细菌使半固体培养基成浑浊状态，粉红色的细菌只在接种针插入的方向聚集，综上所述，紫黑色的细菌为大肠埃希菌，粉红色的为痢疾志贺菌：最后进行药敏试验时，发现大肠埃希菌对青霉素不敏感，对庆大霉素和链霉素都敏感。

在实验过程中，有时会出现一下情况：

4.1在培养基上接种细菌时，有的培养基显示的细菌数量很少，只是聚集在一块地方，这是因为，划线的时候力度不对，把琼脂给划破了，标本都渗进了琼脂里面，再用接种环划线时也不能将细菌分离。所以在培养基上划线不能划破琼脂，实验时应坐着，在酒精灯半径20厘米的范围内操作，以免污染病原菌；

4.2在进行革兰氏染色时，由于用乙醇脱色的时间过长，导致实验结果错误，G﹢和G﹣都是红色，实验失败。在进行革兰氏染色后，一开始由于挑取的细菌数量太多，以致在显微镜下观察到的成团，不能很好地观察细菌的形态。另外，显微镜的物镜镜头没有擦洗干净也有可能导致看不清标本。

4.3在进行糖发酵试验时，试验完成后，管口不能朝上，这是因为管口朝上时，反应过程中产生的气体会溢出，观察不到正确的实验结果，最终会影响到细菌的最终鉴定。

4.4在使用半固体培养基做动力学实验时，结果出来后发现有的半固体培养基变成了液体的状态，这可能是由于制备的过程中没有充分摇匀，导致不同的培养基琼脂的量不同，有的可能就成了液态；也有可能是由于制备的时间过长，等到锥形瓶完全冷却再制备培养基时，锥形瓶中的不同位置的液体浓度已经不同，所以也有可能会做成液态状的本固体培养基。

4.5在进行药敏试验时，可能是挑错了菌落，两种菌都放在一起做药敏试验，导致培养基上所显示的抑菌圈很大，细菌对青霉素、链霉素和庆大霉素都敏感。另外由于培养基的质量、纸片所含抗生素的浓度不同，细菌的数量等也会影响到抑菌圈的大小。

综上所述，正确判断的细菌的种类在指导临床用药方面具有重要意义，只有在正确知道细菌种类的情况下才能对菌用药，否则就会容易造成耐药性的产生，不容易治愈疾病。所以在试验过程中必须严格按照试验的要求去做，操作者药树立一种无菌概念，尽量在无菌环境下操作，从而确保能够得出正确的实验结果。