尖孢镰刀菌 - 图文

33株尖孢镰刀菌遗传多样性的ISSR分析*

张述义1 李新凤2 韦晓艳2 王建明2** ?

（1山西省农业科学院旱地农业研究中心，太原030006；2山西农业大学农学院，山西太谷030801）

摘 要 为明确尖孢镰刀菌种内各菌株间的遗传差异与亲缘关系，采用ISSR分子标记技术对33株地理来源不同的尖孢镰刀菌进行了遗传多样性分析。结果表明，利用筛选出的11条引物扩增出105条条带，其中多态性条带91条，多态性位点比例为86.7%。遗传相似性与聚类分析结果表明，供试菌株间的遗传相似系数为0.606~0.962，平均0.756，当遗传相似系数为0.962时，供试的33株菌可被全部区分开。表明，尖孢镰刀菌基因组在SSR区域具有丰富的多态性。寄主来源相同的供试菌株间的遗传相似性与其地理来源有一定的相关性。 关键词 尖孢镰刀菌；分子标记技术；ISSR-PCR；遗传多样性 中图分类号S43

ISSR analysis of genetic diversity of 33 Fusarium oxysporum strains.ZHANG Shu-yi1，LI Xin-feng2，WEI Xiao-yan2，WANG Jian-ming2(1Center of Dryland Agricultural Research, Shanxi Academy of Agricultural Science, Taiyuan 030006, China; 2Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China). Chinese Journal of Ecology, 2013, 32(5): 1-

Abstract: To clarify the genetic difference and phylogeny relationship among intraspecific strains, the genetic diversity of 33 Fusarium oxysporum strains from different areas were examined by inter-simple sequence repeats (ISSR). The results indicated that a total of 105 bands were amplified with 11 selected ISSR primers, 91 (86.7%) of which were polymorphic. The cluster analysis based on the ISSR data showed that the genetic similarity ranged from 0.606 to 0.962, with the average of 0.756. All the strains tested could be distinguished at 0.962. This indicated that the SSR loci in Fusarium oxysporum genomes were rich in polymorphism. There was some correlation between genetic similarity and geographic origin of strains isolated from the same host.

Keywords: Fusarium oxysporum strains; molecular marker; ISSR-PCR; genetic diversity.

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是镰刀菌属（Fusarium）真菌中一个重要的种，可侵染多种植物引起维管束萎蔫病害，对农业生产造成严重威胁（陈鸿逵和王拱辰, 1992）。由于该菌具有易变异与多型性的特点，种内生理分化十分明显，在种下又可分为多个专化型和生理小种，因此镰刀菌的遗传多样性一直都是该菌的研究热点（O’Donnell, 1996）。多年来，人们都是依据形态学特征、致病性及营养体融合群试验等来研究该菌的多态性，而这些方法既费时费力又不能准确地揭示物种的进化关系。

随着分子生物学的发展，分子标记技术已被广泛应用于真菌类群的多样性分析，国内外研究表明，运用分子生物学相关技术分析镰刀菌遗传多态性能从DNA水平上反映菌株间的本质差异(Yli-Mattila et al., 2002；Konstantinova & Yli-Mattila, 2004；Visentin et al., 2009）。目前，应用于镰刀菌遗传多样性分析的分子标记技术主要有RFLP、AFLP、RAPD、rDNA-ITS、ISSR等，ISSR简单序列重复区间标记技术与其他技术相比，具有重复性好、多态性丰富、费用低、操作简便等优点，已被广泛地应用于各物种的遗传多样性及相关领域的研究（甘琴华等, 2008；谷守芹等, 2008；毛岚等, 2009；李挺丹等, 2010；赵云福等, 2010）。研究表明， ?

*山西省科技攻关项目（20100311019-2）、山西省自然科学基金(2006011080)和山西省科技攻关项目(20120311019-3)资助。

**通讯作者 E-mail: jm.w@sohu.com

收稿日期：2012-09-23 接受日期: 2013-01-14

该技术在分析镰刀菌的遗传多态性方面，特别是种内遗传多样性上有其独特的优势（Mishra et al., 2003；Mishra et al., 2004；李蕊倩等, 2009；Dinolfo et al., 2010）。目前，尖孢镰刀菌遗传多样性的研究多集中于个别专化型内各菌株的研究（Haware et al., 1995；Balmas et al., 2005；段会军等, 2008；Bayraktar et al., 2008；Dubey & Singh, 2008；Baysal et al., 2010；苑琳等, 2012），有关种内不同寄主和地理来源的菌株间的ISSR遗传多样性分析未见报道，因此在传统分类基础上，应用ISSR分子标记技术研究尖孢镰刀菌种内的遗传差异与系统发育，建立各进化类群与形态学特征的关系，对尖孢镰刀菌的分类鉴定、尖孢镰刀菌萎蔫病害的防治和相关领域的研究具有重要的理论和实际意义。

本研究以采自山西省不同地区不同寄主的33株尖孢镰孢菌与河北的2株尖孢镰孢菌为研究对象，采用ISSR-PCR技术对其进行遗传多样性研究，并探讨其遗传多样性与寄主和地理分布的关系，旨在为今后深入开展尖孢镰刀菌的遗传分化和系统发育等研究提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料

供试菌株：供试菌株为分离自不同寄主作物上的尖孢镰刀菌单孢分离物，其寄主及采集地如表1所示。结合Booth分类系统与Leslie分类方法对供试菌株进行形态学鉴定（BoothBooth, 1988；Leslie & Summerell, 2006）。

供试引物：13个ISSR引物自加拿大英属哥伦比亚大学（University of British Columbia）公布的序列中选出（周延青, 2005），由北京赛百盛生物技术有限公司合成。

试验仪器：PCR基因扩增仪（MJReasearch USA）、凝胶成像分析系统（Sigma公司）、DYY-11型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）等。

试验试剂：RNaseA、DNA maker、TaqDNA Polymerase、dNTP购于北京天根生物技术有限公司。

表1 供试菌株及来源

Table 1 Tested isolates and their locations in the study 编号 寄主 菌株

1 绿豆Vigna radiata 尖孢镰

刀菌

2 蚕豆Peronospora viciae 尖孢镰

刀菌

3 地豆Phaseolus vulgaris 尖孢镰

刀菌

4 黄瓜Cucumis sativus 尖孢镰

刀菌

5 黄瓜 尖孢镰

刀菌

6 黄瓜 尖孢镰

刀菌

7 黄瓜 尖孢镰

刀菌

8 黄瓜 尖孢镰

刀菌

9 西瓜Citrullus lanatus 尖孢镰

刀菌

1黄瓜 尖孢镰0 刀菌

1西瓜 尖孢镰1 刀菌

1西瓜 尖孢镰2 刀菌

1西葫芦Cucurbita pepo 尖孢镰3 刀菌

1番茄Lycopersicon esculentum 尖孢镰4 刀菌

1番茄 尖孢镰

采集地

山西祁县

山西太谷

山西太谷

山西夏县

山西夏县

山西太谷

山西太原

山西太谷

山西夏县

山西太原

山西祁县

山西太谷

山西太谷

山西太谷

山西

5

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

刀菌

辣椒Capsicum annuum 尖孢镰

刀菌

茄子Solanum melongena 尖孢镰

刀菌

茄子 尖孢镰

刀菌

茄子 尖孢镰

刀菌

茄子 尖孢镰

刀菌

棉花Gossypium sp. 尖孢镰

刀菌

棉花 尖孢镰

刀菌

棉花 尖孢镰

刀菌

胡麻Linum usitatissimum 尖孢镰

刀菌

芝麻Sesamum indicum 尖孢镰

刀菌

芝麻 尖孢镰

刀菌

兰花Michelia chapensis 尖孢镰

刀菌

兰花 尖孢镰

刀菌

兰花 尖孢镰

刀菌

茄子 尖孢镰

刀菌

西瓜 尖孢镰

刀菌

番茄 尖孢镰

刀菌

西瓜 尖孢镰

刀菌 大同

山西太谷

山西祁县

山西五寨

山西太谷

山西阳城

山西运城

山西襄汾

山西太谷

山西大同

山西襄汾

山西祁县

河北保定

河北保定

山西长治

山西神池

山西太谷

山西太谷

山西祁县

1.2 研究方法

1.2.1 菌体培养与模板DNA的制备 菌体培养：将供试尖孢镰刀菌菌种经PDA平板活化后，接种到查彼培养液中，25 ℃恒温振荡培养5 d，然后抽滤菌丝，将其烘干。

模板DNA的制备：采用改进的SDS-CTAB法抽提镰刀菌基因组DNA（Lodhi et al., 1994），所提取的DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳后，在GIS凝胶成像分析系统中拍照，分析荧光强度，以标准DNA分子量作对照，并用紫外吸收法检测DNA浓度，然后将DNA浓度稀释成20 ng·μL-1，贮存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 ISSR扩增反应 ISSR扩增反应体系（李蕊倩等, 2009）：PCR反应体系为20 μL，其中包含1.0 U TaqDNA聚合酶、1.5 mmol·L-1 MgCl2、0.15 mmol·L-1 4×dNTP、0.5 μmol·L-1引物、20 ng模板DNA。

PCR扩增反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。

1.2.3 ISSR引物筛选与PCR产物检测 随机选取3个供试菌株的基因组DNA为模板，利用合成的ISSR引物对其进行扩增，然后比较扩增结果，从中选择多态性和重复性好的引物对33株供试菌株的基因组进行PCR扩增，反应结束后，用1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5 mg·L-1核酸染色剂）将扩增产物进行分离，并用GIS凝胶成像分析系统对电泳分离结果观察拍照。 1.2.4 电泳谱带的记录及数据统计分析 电泳图谱中每条扩增带均代表了引物与模板DNA互补的1个结合位点，可记为1个分子标记。将PCR扩增的DNA条带转换成二进制数据，记录每条引物对每个菌株的扩增结果，电泳图谱中相同迁移位置上有扩增带的记为1，无带的记

为0。利用NTSYSpc（Version 2.11e）软件计算供试各菌株间的遗传相似系数，并进行聚类（UPGMA）分析与主成分分析（PCA）。 2 结果与分析

2.1 ISSR引物筛选与PCR扩增结果

根据引物筛选的扩增结果，从13条引物中筛选出11条扩增条带清晰、多态性明显、重复性好的引物，对33株供试尖孢镰刀菌菌株进行了ISSR-PCR扩增。结果表明（表2），当退火温度为52 ℃或54 ℃时，这些引物都具有良好的扩增多态性，共扩增出105条条带，不同引物扩增条带数不同，多数为8~12条。其中，807、831、891号引物扩增出的条带数最多，为12条；引物809扩增出的条带数最少，为4条，这些条带多分布在400~2000 bp（图1），其中特征性条带（多态性位点）为91条，多态性位点比例为86.7%，平均每个引物产生多态性条带8.3条。

表2 11 条ISSR引物对33株尖孢镰刀菌的扩增结果

Table 2 Amplification results of 33 Fusarium oxysporum strains with 11 ISSR primers 引物 807 808 809 812 831 835 882 883 884 885 888 889 891 合计Total

序列 （AG）8T （AG）8C （AG）8G （GA）8A （AC）8YA （AG）8YC VBV（AT）7 BVB（TA）7 HBH（AG）7 BHB（GA）7 BDB（CA）7 DBD（AC）7 HVH（TG）7

退火温度(℃) 54 54 54 52 52 52 54 54 54 52 54 54 52

扩增条带 12 9 4 8 12 8 - - 9 10 11 10 12 105

多态性条带 11 6 4 5 11 8 - - 8 8 10 9 11 91

多态性比例(%) 91.7 66.7 100 62.5 91.7 100 0 0 88.9 80 90.9 90 91.7 86.7