质粒小提取试剂盒

质粒小提取试剂盒（离心柱型）

储存条件

本试剂盒在室温（15-25℃）干燥条件下，可保存一年；更长时间的保存置于2-8℃.若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNaseA在室温可稳定保存一年以上。加入RNaseA后的溶液P1应置于2-8℃保存，可稳定保存半年。

产品简介

本试剂盒采用碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料。高效、专一吸附DNA。以下操作步骤适用于1-5ml过夜培养的大肠杆菌，质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性抗生素等因素有关。

使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

注意事项

1) 溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒提供的RNaseA全部加入），

混匀，置于2-8℃保存。

2) 第一次使用应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。 3) 使用前请先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，若有浑浊现象，

可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

4) 注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧瓶盖。

5) 所有离心步骤均匀使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为

12,000rpm(～13400×g)。

6) 提取的质粒量与细菌培养溶液浓度、质粒拷贝数等因素有关。 7) 实验前使用平衡液处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜。提高得率。 8) 用平衡液处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。 9) 去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+宿主菌

（TG1、BL101、HB101、JM系列，ET12567）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。

操作步骤

1) 柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡

液BL，12,000rpm(～13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2) 将4.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，

12,000rpm(～13400×g)离心1min，尽量吸取上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3) 向留有菌液的离心管中加入250μl溶液P1（请先检查是否已加入

RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4) 向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5) 向离心管加入350μl溶液P3（，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，

此时将出现白色絮状沉淀12000rpm(～13400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀，12000rpm(～13400×g)离心30-60s。倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7）可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm(～13400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1、BL101、HB101、JM系列，ET12567等）这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α、TOP10等），这步可省略。

8）向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否加入无水乙醇），12000rpm(～13400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9）向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm(～13400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液。

10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，目的将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶切反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中的残余的漂洗液。

11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加80μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，2000rpm(～13400×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大的影响。如后续做测序，需使用去离子水做洗脱液，并保证其PH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的PH值调到此范围），PH值低于7.0会降低洗脱效率。但DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。