第二十六章 干细胞培养与动物克隆技术

第二十六章 干细胞培养与动物克隆技术

在胚胎发育过程中，细胞分裂不仅产生了新的细胞种类，而且使胚胎细胞数量不断增加。在一个成熟的有机体内，细胞分裂的重要功能是维持各分化类型的细胞数量在一个稳定水平：补充或替换老化、死亡和受损害的细胞。

细胞分裂速度能直接衡量机体组织的更新速度，据此Leblond（1963）把一个成年有机体组织分为三种类型：（1）没有细胞分裂、细胞数量恒定的组织。当时认为神经和骨骼肌细胞是不能分裂的，属于这种类型；（2）细胞有条件自我更新的组织，如肝脏。在有适当的刺激时，大多数肝细胞能去分化、分裂产生新的肝细胞；（3）永远具有自我更新（Self-renewal）能力的组织，包括血液、性腺、复层鳞状上皮等。由于组织中的末端分化细胞的寿命一般较短，因此必须有一个类群的细胞通过不断分裂、分化产生相同的末端细胞来弥补组织细胞数量的损失，承担这项工作的就是存在于组织中与其他细胞有明显区别的细胞亚群——干细胞（stem cell）。

然而，原来被认为没有细胞分裂的组织，如神经组织现在也发现有神经干细胞。在灵长类和人类，无论是幼体还是成体的脑和脊髓都存在神经干细胞，并且发现在某些特定情况下，通常处于静止状态的神经干细胞也参与神经损伤的细胞替换（Horner and Gage, 2000），也就是说在神经组织中也发现有细胞分裂，而且小鼠脑神经干细胞在移植实验中具有分化成多种血细胞的能力（Bjornson et al, 1999）。这表明随着干细胞生物学的发展，许多全新的研究成果正在不断改变人们形成多年的陈旧观念和思维，干细胞也正在将以前人们的梦想和认为是不可思议的事情变成活生生的现实。

目前，不仅分离培养了许多动物种类的胚胎干细胞（embryo stem cells, ES），而且在许多成熟组织也发现了干细胞，包括脑和脊髓等几乎看不到有丝分裂的组织。因此对组成有机体的所有细胞应该有一个重新认识，根据细胞的分化能力可以分为三级：最高一级是干细胞，具有多种分化能力，可以自我更新，并参与有机体一生的组织修复；其次是过渡增殖细胞（transit amplifying cells），也叫做定向祖细胞(committed progenitor)，由干细胞分化、在有机体内存在的一种只有有限分化能力的细胞；最后一级是成熟组织中行使功能的末端分化细胞(terminal differential cells)或成熟细胞(mature cells)，不能自我修复，也不具有分化能力。

第一节 干细胞的生物学特性

一、干细胞的命名

干细胞通常以其组织来源命名，如胚胎干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等。在骨髓中发现了两种干细胞，分别叫做骨髓造血多能干细胞和骨髓间充质干细胞。目前在许多组

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织发现的干细胞中，有些组织干细胞是“活动”的，不断通过自我更新补充组织细胞，如多能造血干细胞。也可能是“静止”的，如哺乳动物脑组织中的神经干细胞一般处于不分裂状态，还有肝脏干细胞也是“静止”的，只是在当肝脏受到极大损伤后才被激活分裂。

二、干细胞的类型

干细胞就其来源可分为两类：胚胎组织源性的胚胎干细胞，ES细胞和EG细胞；源于成熟组织的干细胞叫做组织干细胞。就发育潜能而言，ES和EG细胞理论上可分化成各种类型的组织细胞，因此又被称为全能干细胞（totipotent stem cell）；一般成熟组织中的干细胞现在还没有测试其向各种分化细胞发育的能力，或一般只具有分化成组织源性类型细胞的能力，称之为多能干细胞（multipotent stem cell）。例如，多能造血干细胞可分化出红细胞、单核细胞和血小板等8个细胞谱系，故造血干细胞具有多能性。更新皮肤的干细胞只具有产生一种分化细胞的能力，称为单能干细胞（unipotent stem cells）。但是目前已证实成熟小鼠神经干细胞和骨髓间充质干细胞显示出具有分化多种细胞的能力（Brazekton, Rossi, 2000; Mezey et al, 2000），如骨髓间充质干细胞可以分化为肌肉细胞、神经细胞、神经胶质细胞、肝细胞等。因此，在适当的诱导条件下某些成熟组织中的干细胞也能分化成为组织起源以外的细胞。

三、干细胞的定义

要给所有来源的干细胞下一个确切的定义是比较困难的，因为不同的干细胞各有自己的特点。ES细胞源于胚胎，具有二倍体核型，能在体外长期传代培养且保持最原始的发育全能性，体外诱导能够产生各种类型的分化细胞或组织。成熟组织干细胞如骨髓中的多能造血干细胞相对于ES细胞而言就是一种分化细胞，因为胚胎干细胞可以在体外诱导成造血干细胞，表皮干细胞的分化程度则更高。成熟组织干细胞是多能性细胞，目前在实验室经一段时间培养后容易失去其分裂和分化能力。

目前认为，所谓干细胞就是指这样一类细胞，具有无限的或可被延长的自我更新能力、并且能形成至少一种高分化后代的细胞(Watt et al, 2000)。

虽然如今对某些种类干细胞的结构属性在形态学和分子水平上进行鉴定已经成为可能（目前待选的因子包括高水平表达的广谱抗药基因及某些整联蛋白（integrin），但是干细胞的重要功能基础在于它们的全能性（或多能性），因此仍然以干细胞的功能来鉴定干细胞。鉴于不同种类干细胞分化程度不同，因此也有人认为与其把干细胞看成是未分化细胞，不如视其为在特定组织微环境下存在的适度分化细胞，并且在不同的微环境中能显示更多的潜在基因型（van der Kooy and Weiss, 2000）。

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四、干细胞的分化途径

干细胞在分化形成末端分化细胞时，必须经过一种中间类型的细胞——定向祖细胞或过渡增殖细胞，然后由定向祖细胞进一步分化为成熟细胞（图26-1）。

干细胞 定向祖细胞 分化细胞

图26-1 干细胞的分化途径。

干细胞有无限的自我更新能力。在分化形成分化细胞时，必须先分裂产生具有有限

增殖能力和分化潜能的定向祖细胞，然后由定向祖细胞进一步分化形成分化细胞。

干细胞与定向祖细胞都有增殖能力，但是有区别。干细胞具有无限的自我更新能力，然而干细胞的分裂不频繁，且数量保持稳定。定向祖细胞增殖能力有限，有一定的分化潜能，它是干细胞最终形成某种末端分化细胞的祖先细胞（progenitor cells）。在组织再生或补充细胞时，主要由存在组织中的定向祖细胞分裂产生，其分裂速度要快于干细胞，但是干细胞也要周期性地分化，产生定向祖细胞以补充其数量。末端分化细胞指分化标记基因全部表达、没有继续分裂能力、寿命较短的细胞，它所处的状态为发育完成阶段、是一种功能末端细胞。例如网织红细胞、嗜中性粒细胞等，但是也有末端分化细胞的寿命很长，如神经细胞。

表27-1列出了干细胞、定向祖细胞和末端分化细胞的主要区别，这也从一个方面表明了鉴定干细胞的准则。无论干细胞源于何种组织，应该有如下特性：（1）是一种未分化的细胞（在一种特定的组织中，不表达分化标记蛋白）；（2）具有周期性或重复性的增殖能力；（3）能够自我更新产生同样具有全能性子代细胞的能力（定向祖细胞一般不具有这种能力，因为其分裂产生的增殖细胞都将成为末端分化细胞）；（4）能够长期产生高度分化的功能性子代细胞；（5）能够再生修复受到损伤的组织（Loeffler and Potten,1997）。

表27-1 干细胞、定向祖细胞和末端分化细胞的区别 是否表达分化标记蛋白 增殖能力 自我更新能力 产生分化后代的能力 参与受损组织的再生能力 干细胞 没有 无限 无限 有 长期有 定向祖细胞 开始具备 有 无 有限 暂时有 末端分化细胞 有 无 无 无 无 494

五、干细胞的不对称分裂

组织中的干细胞在维持组织细胞数量稳定、以及组织再生时有重要作用。组织干细胞一般是长期存在，且数量相对稳定，这就是干细胞的自我维持（self-maintance）能力。干细胞是通过什么分裂方式保存自己、补充和维持组织细胞数量的呢？

通常认为干细胞产生子代和自我维持是以一种不对称分裂（asymmetric division）方式进行的。在稳定状态下，有两种极端的分裂方式都可以达到不对称分裂的结果，一种是稳定的不对称分裂（invarient asymmetry），一种是群体不对称分裂（populational asymmetry）。稳定的不对称分裂在单细胞生物和无脊椎动物（如酵母、果蝇和线虫）很普遍，即一个干细胞分裂产生的两个子代细胞中，一个总是分化为定向的祖细胞，继续分裂将成为末端分化细胞补充组织，另一个总是是干细胞，以维持干细胞的数量保持不变（图26-2A）。

然而大多数哺乳类干细胞不属于这种稳定的不对称分裂方式。就单个干细胞而言，哺乳类干细胞通常是一种对称分裂（symmetric division），即分裂的两个子代细胞或都是干细胞，或都是定向祖细胞（Morrison et al, 1997）。如果就整个干细胞群体分裂产生的干细胞和定向祖细胞的数量来看，依然是不对称分裂。因为在一个稳定的分裂状态下，平均每个分裂的干细胞依然是产生一个干细胞和一个定向祖细胞（Watt and Hogan, 2000）（图26-2B）。另外，在一些组织，单个干细胞的这种对称分裂方式行为具有连续性，即一个干细胞分裂时产生的子代如果是干细胞，则下一次分裂的子代细胞依然是干细胞；反之，如果分裂产生的子代是定向祖细胞，则连续分裂的结果也依然是祖细胞子代，而不产生不连续的干细胞子代和祖细胞子代（Jensen et al, 1999）。

以上两种极端的分裂方式产生机制很不相同，但是有一点是共同的，即都受到了多方位（干细胞内部和生存小环境信号）的反馈调控和细胞相互作用的影响。群体不对称分裂方式使机体对各种突发损伤以及正常的生理需要能很快产生相应反应。例如机体受伤失血后，多能造血干细胞能以两个子细胞都是定向祖细胞的对称分裂方式迅速生成足量血细胞补充。表皮干细胞也可以通过这种方式应付突发的皮肤受损等等（Watt and Hogan, 2000）。

六、干细胞的一般特性

1．发育的全能性或多能性

ES细胞具有发育的全能性，在体外适当条件下能够长期传代培养不失去分化的全能性，冻存、复苏也不产生影响。小鼠ES细胞在实验室培养10多年依然具有最初的发育全能性；美国科学家将人类胚胎干细胞进行克隆，建立了源于单个干细胞的人类ES细胞系，并成功在体外传了250代。易于体外培养又保持全能性（多能性）特点为干细胞的研究和实际应用提供了取之不绝、用之不尽的材料来源。

长期以来人们都认为组织干细胞只具有发育多能性，只能分化出来源组织的细胞类型。但是，目前有研究报道组织干细胞也可以分化成来源组织分化细胞以外的类型，如骨髓间

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