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③共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；
1. 实现细胞全能性的两个条件是什么？①必须把细胞从植物体的相应部位分离出来。②必须给予它们适当的刺激，尤其是激素的作用。
2. 配制母液的好处是什么？使用母液可以保证培养基各成分的准确性，配制及使用的方便性，从而显著提高工作效率。
3. 试管苗为什么不能直接移植于大田？由于试管苗的生长环境不同于自然外界环境，因此其具有高湿、弱光、恒温、低透气性等特点。所以需要驯化后才能移栽。 二、基因工程原理：
3、重组DNA技术的三大基本元件：供体、受体、载体。 4、基因工程基本用途（意义）①分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；②大规模生产生物活性物质（基因调节）；③设计、构建生物的新性状甚至新物种（正义、反义） 5，与形态学标记，细胞学标记生化标记相比，分子标记具有哪些明显的优越性？
1直接以DNA形势表现，在生物体的各个组织，各各个发育阶段均可检测到，不受季节，环境限制，不存在表达与等问题。2数量基多，遍布整个基因组，可检测的座位几乎是无限的。3多态性高，自然界存在许多等位变异，无需人为创造。4表现为中性，不影响目的性状的表达5许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体、 5、基因克隆中三个基本要点是：
基因克隆就是PCR技术，三个基本要点是：①变性（将DNA加热到90-95度）。②复性（将DNA降温至55-60度）。③延伸（将DNA升温到70-75度）。 基因工程的基本程序包括：获得目的基因——重组质粒——构建基因工程菌——工程菌大规模培养——分离提取目的产物。
6.作为基因工程载体，必须满足哪些条件？
1可转移性，即能携带目的基因进入宿主细胞。2可自主复制，能在宿主细胞中实现目的基因的增值。3多克隆位点，由单一的限制性内切酶识别位点组成4合适的选择标记。用于重组质粒的宿主细胞筛选。
7、基因工程操作的基本步骤是什么？ ①获得目的基因（DNA片段）；②目的基因克隆（复制）与验证；③表达载体构建：将目的基因与载体组合成能在目的生物中表达的形式（重组 DNA）；④转化：把重组DNA引入某种受体生物或细胞；⑤筛选：从大量的受体中筛选出可能具有目的基因且目的基因能够表达的个体或细胞。
一、生物技术与农业：（1）、植物基因工程育种：培育抗病虫作物、抗逆育种、抗除草剂育种、品质种改良（2）植物细胞工程1、植物次级代谢细胞：利用植物细胞培养生产的植物次生代谢产物包括药用成分、香料、色素、杀菌剂等，已经成功培养出紫草宁、人参皂苷、紫杉醇、阿马里新等一系列的天然植物次生代谢物质，植物次生代谢产品的市场潜能2、快速无性繁殖3、原生质体融合4、花粉、花药和胚的培养5、遗传转化中的应用6、物质资源保存（3）生物医药 1、我国首次利用除虫菊成功开发出无公害农药，2、苏云金芽孢杆菌是应用最广的杀虫细菌3、白僵菌是防止鳞翅目昆虫的真菌制剂4、昆虫病毒5、生物肥料（4）动物基因工程育种：动物分子育种技术主要包括基因工程技术、细胞工程技术、胚胎工程技术等（5）动物繁殖新技术：1、人工授精及精液的冷冻保存2、胚胎移植及胚胎的冷冻保存3、体外胚胎生产4、胚胎分割技术性别控制技术5、性别控制技术（6）1、DNA重组生长激素的作用2、利用微生物发酵技术生产饲料添加剂3、寡糖、寡肽类饲料添加剂或称益生素（7）动物生物反应器：利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官或组织，进行工业化生产功能蛋白质的技术。主要是乳腺生物反应器 未来石油的替代物——乙醇 优
点：产能效率高、燃烧不产生CO等有害物质污染小、可通过微生物发酵大量生产成本低。乙醇只要是由酵母菌以蔗糖和淀粉为原料进行发酵产生的。
二、生物技术与安全：1、对人和动物的潜在危害：致病性、抗药性、食品安全性2、对生态环境的潜在危害：致病性和毒性、生存竞争力、传播扩散能力、遗传变异能力、遗传转移能力3、转基因作物4、生物武器：目前世界上公认的对人类危害最大的最易散发的三种生物武器是：炭疽杆菌、天花病毒、肉毒杆菌。 三、工具酶：限制性核酸内切酶 2、粘性末端的意义？连接方便：①不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。②同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
2.影响限制性酶活性的因素有哪些？在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增
加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切(星号活性)。
当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施? 为什么? 注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。
6、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。用属名的第一个字母和种名的头两个字母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示。用一个大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马字母表示。如EcoR I
8、什么是限制性内切核酸酶的星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和切割效率的改变？受哪些因素的影响? ①DNA的纯度。②DNA的甲基化程度。③ 温度 Tm。④缓冲液 Buffer。 10、计算下列两种酶各自在某染色体DNA 序列上识别位点间的平均距离：Alu I：5’ AGCT 3， EcoR I: 5’GAATTC 3’ 四、工具酶：连接酶与聚合酶
1、DNA连接酶的定义：把两种来源的DNA（用同一种限制酶切割）的黏性末端粘合起来。 2、DNA连接酶连接反应的条件：①必须是两条双链DNA。②DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。③需要能量。
3、影响DNA 连接酶连接反应的因素主要有哪些？ ⑴插入片段与载体的浓度比例。 ①10~20倍。②增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 ⑵反应温度：12.5℃。一般14~16℃。 4、DNA 连接酶的连接机理是什么？ ①ATP（NAD+)提供激活的AMP一磷酸腺苷 。 ②ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 ③AMP-氨基相连。 ④AMP-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 ⑤3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 5、DNA 连接酶的作用特点有哪些？ 6、DNA聚合酶的特点：
DNA聚合酶的特点为需要DNA模板、需要RNA或DNA做为引物、催化dNTP加到引物的3′末端。
DNA聚合酶以四种三磷酸脱氧核苷为原料，这种酶的共同性质是：
①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶（DNa dependent DNA polymerase， DDDP）。
②需要RNA或DNA做为引物（primer），即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。 ③催化dNTP加到引物的3′末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。
三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。 7、DNA聚合酶与DNA连接酶的异同点？ ⑴相同点：催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。 ⑵不同点：①连接酶不需要模板，聚合酶需要ＤＮＡ的一条链为模板；②连接酶的作用对象是游离的DNA片段，聚合酶的作用对象是单个的脱氧核苷酸；③ 连接酶的作用结果是形成完整的DNA分子，聚合酶的作用结果是形成DNA的一条链；④连接酶用于基因工程，聚合酶用于DNA复制。 五、载体与质粒：
3、克隆载体必须具备什么条件? ①具有使外源DNA片段插入的限制性酶识别位点（外源性DNA能组入）.②能将外源DNA导入到受体细胞并进行自我复制（能繁殖）。③必须具有选择标记（能筛选出来）。 4、基因工程中有三种主要类型的载体：质粒型载体、病毒型载体、混合型载体
5、pUC 质粒利用α-互补作用筛选重组子原理是什么？（蓝白斑实验） 基因载体上含有?-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，当外源DNA插入到载体的LacZ基因上后将造成?-半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X-gal-IPTG（异丙基-?-D-硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化直接观察出来。
5、举例说明什么是穿梭载体？ 是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在 E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。 6、表达载体必须具备的条件？ ①载体能够独立的复制；②应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选；③应具有很强的启动子，能被RNA聚合酶所识别；④应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；⑤应具有很强的终止子，以使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，同时使很强的终止子所产生的mRNA较为稳定；6、所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，以便转录后能顺利翻译。 2、未知基因的获得途径？ ①构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因。②构建cDNA文库，筛选目的基因。③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因。④酵母双杂交体内鉴定基因。
3、利用用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断的优点和缺点？？ 优点：如果带有粘性末端，产物可以直接与载体连接，连接效率高。 缺点：①目的基因内部可能有内切酶的切点， 目的基因也被切成碎片。②消化的片断分子量太大或太小，不符合载体容量，不能克隆。
4、基因组文库定义？什么是cDNA 文库？同基因组文库有何差别? ⑴基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。 ⑵cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。 ⑶区别：⑴克隆均一性：cDNA文库大小不一，基因组文库大小基本一致。⑵基因覆盖率：
cDNA文库包含部分基因，基因组文库包含所有基因。
5、构建基因组文库时连接方法主要是粘性末端连接法；而构建cDNA 文库，可用接尾连接法或人工接头连接法。
6、构建cDNA文库的一般步骤？ ①细胞总DNA的提取和mRNA的分离。②第一链cDNA合成。③第二链cDNA合成。④双链cDNA的分级分离。⑤双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。⑥重组体的筛选与鉴定。
分离基因文库中目的基因的方法有：核酸杂交法、差别杂交筛选、mRNA差别显示法、酵母双杂交筛选法 （建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆？）用目的基因制作一个引物，进行pcr扩增就知道究竟克隆载体是否带有目的基因片段了。 七、转基因育种
1、作物转基因育种定义及其优势： 优势：①拓宽可利用的基因资源； ②培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径； ③可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择； ④可以大大提高选择效率，加快育种进程。 ⑤此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品
2、定义:就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。
3、植物遗传转化的表达载体有哪两大类？①质粒载体系统；②病毒载体系统。 4、一元载体系统；双元载体系统定义；二者的不同
一元载体系统（整合载体系统）：这一类载体系统由外源基因表达结构和改造后的卸甲(去掉致瘤基因，disarmed)Ti质粒组成。
在农杆菌内，通过同源重组将外源基因整合到修饰过的T-DNA上，形成可穿梭的共整合载体，在Vir基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。 但这类方法构建困难，整合体形成率低 。
双元载体系统：它由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒即：微型Ti质粒（mini-Ti plasmid，相当于T-DNA ）、辅助Ti质粒（helper Ti plasmid，相当于vir区）。 T-DNA和Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移到植物细胞基因组内。
微型Ti质粒就是含有T-DNA边界但缺失Vir基因的Ti质粒，为一个广谱质粒。它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点（OriV），同时具有选择性标记基因。
辅助质粒为含有Vir区段但T-DNA缺失的突变型质粒。因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。其作用是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA转移。 与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。
5、农杆菌转化法的步骤及其优点。 步骤：①植物受伤: 植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、 羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。 ②感染植物:农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。 ③毒性基因（vir）表达:virA、virG、virD、virB。 ④T-DNA转移:T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。
⑤诱导冠瘿瘤: T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 ⑥土壤农杆菌代谢冠瘿碱。 优点:①多为单拷贝或寡拷贝整合，转基因遗传较稳定，减少了共抑制等基因沉默现象． ②属于单细胞转化，不存在嵌合体现象；③成本较低，转化效率较高。 ④具有高多态性和易于检测等优点，实验重复性好，结果可靠； ⑤由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。
6、AFLP技术基本原理： ①基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段 ②将特定双链接头连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特异片段，作为DNA扩增的模板 ③根据接头的序列和酶切位点设计引物，即接头+酶切位点+2-3个核苷酸，然后进行特异性PCR扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可产生数量丰富的带型标记，分辨率高，是一种十分理想和高效的遗传标记。 ④接头序列以及与其相连的限制位点作为随后进行的限制片段扩增的引物结合位点 ⑤PCR引物3’末端含有选择核苷酸，选择核苷酸延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增 ⑥扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。
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