植物肉桂酰辅酶A还原酶 - CCR - 基因的研究进展 - 李波 - 图文

分子植物育种，２００６年，第４卷，第３（Ｓ）期，第５５－６５页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３（Ｓ），５５－６５

专题介绍Ｒｅｖｉｅｗ

植物肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ＣＣＲ）基因的研究进展

李波

梁颖＊柴友荣＊

西南大学农学与生命科学学院，农业部生物技术与作物品质改良重点实验室，重庆市油菜工程技术研究中心，重庆，４００７１６＊通讯作者，ｙｌｉａｎｇ＠ｓｗａｕ．ｃｑ．ｃｎ，ｃｈａｉｙｏｕｒｏｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ

植物体内通过公共苯丙烷途径而进入木质素特异途径来合成木质素，这条代谢途径涉及到许多酶的参与，其中肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ｃｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＣＣＲ）是木质素特异途径的第一个关键酶，可催

摘

要

化３种羟基肉桂酸的ＣｏＡ酯的还原反应，生成相应的肉桂醛。因此人们认为此酶可能对木质素合成途径的碳流具有潜在的调控作用，对木质素单体的生物合成起着重要作用。本文主要综述了ＣＣＲ在木质素生物合成途径中的地位、ＣＣＲ的分布、酶的提取和基本特性、ＣＣＲ基因的克隆进展、ＣＣＲ基因的转录特点、ＣＣＲ启动子研究情况、转基因植物中表达抑制ＣＣＲ基因的生物学效应等，并展望了ＣＣＲ基因研究对于植物木质素研究、植物抗病和抗逆性研究、作物品质改良以及植被保护研究的意义。

关键词

进展，木质素，肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ＣＣＲ），生物合成途径

ＡｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓｉｎＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＰｌａｎｔＣｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡＲｅｄｕｃｔａｓｅ（ＣＣＲ）Ｇｅｎｅｓ

ＬｉＢｏ

ＬｉａｎｇＹｉｎｇ＊ＣｈａｉＹｏｕｒｏｎｇ＊

ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＲａｐｅｓｅｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＫｅｙＬａｂｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆ＣｒｏｐＱｕａｌｉｔｙＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡ－ｇｒｏｎｏｍｙａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４００７１６＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒｓ，ｙｌｉａｎｇ＠ｓｗａｕ．ｃｑ．ｃｎ，ｃｈａｉｙｏｕｒｏｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ

ＡｂｓｔｒａｃｔＬｉｇｎｉｎｉｎｐｌａｎｔｓｉｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｖｉａｔｈｅｌｉｇｎｉｎｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｗｈｉｃｈｉｓｊｕｓｔｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｃｏｍｍｏｎｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｐａｔｈｗａｙ，ａｎｄｍａｎｙｅｎｚｙｍｅｓａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｉｓｐｒｏｃｅｓｓ．Ｃｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＣＣＲ）ｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｋｅｙｅｎｚｙｍｅｏｆｌｉｇｎｉｎｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｗａｙａｎｄｃａｔａｌｙｓｅｓｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎ－ｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡｅｓｔｅｒｓｔｏｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ＣＣＲｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｃｏｎｔｒｏｌｐｏｉｎｔｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｏｖｅｒａｌｌｃａｒｂｏｎｆｌｕｘｉｎｔｏｌｉｇｎｉｎｐａｔｈｗａｙ，ｔｈｕｓｉｔｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｍｏｎｏ－ｌｉｇｎｏｌｓ．ＴｈｉｓｐａｐｅｒｍａｉｎｌｙｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＣＣＲｉｎｌｉｇｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ，ＣＣＲｅｎｚｙｍｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓｉｎＣＣＲｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｅａｔｕｒｅｓｏｆＣＣＲｇｅｎｅｓ，ｓｔａｔｕｓｏｆＣＣＲｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ，ａｓｗｅｌｌａｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＣＲｇｅｎｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣＣＲｇｅｎｅｓｉｎｐｌａｎｔｌｉｇｎｉｎｒｅｓｅａｒｃｈ，ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓａｎｄａｄｖｅｒｓｉｔｙｔｏｌｅｒａｎｃｅｓ，ｃｒｏｐｑｕａｌｉｔｙｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｖｅｇｅｔａｔｉｏｎｓ，ａｒｅａｌ－ｓｏｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄ．

ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ，Ｌｉｇｎｉｎ，Ｃｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＣＣＲ），Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ木质素是包围在木纤维等管束细胞和厚壁细胞壁外的一类多聚物质，是植物体中总量仅次于纤维素的第二大有机物，也是最大一类次生物质，占植物总生物量的３０％。木质素对维管植物的生长发育是必要的，在陆生植物进化过程中是一个非常重要的因子，在地球碳循环中占有重要地位。木质素由苯丙烷衍生物以醚键或碳键（少数）连接而成，分子量从几百到几百万，与纤维素、半纤维素合称为“三素”，通

过光合作用储存在植物体内的太阳能中木质素约占

４０％（ＡｎｔｅｒｏｌａａｎｄＬｅｗｉｓ，２００２；付伟等，２００４）。在木本植物中木质素的含量约占２７％￣３２％（绝对干原料重），草本植物中约占１４％￣２５％（陈慧泉等，１９９６）。木质素参与细胞壁木质化过程，加大细胞壁的硬度或抗压强度，促进机械组织的形成，除参与形态建成外，其总体含量、各单体的比例对于植物抗倒伏、抗病和抗逆性具有重要影响。木质素含量过高使造纸

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分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

工业的污染增加，动物对饲草的消化吸收率降低，过高的木质素也影响一些作物的品质。研究木质素生物合成的分子机理，通过基因工程等手段对植物木质素的含量和单体比例进行调控，在造纸原料、作物适应性、作物品质等的改良方面具有重要的应用前景。木质素是苯丙烷代谢途径的重要产物之一，其生物合成涉及到许多酶的参与。肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ｃｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＣＣＲ，ＥＣ１．２．１．４４）又叫阿魏酰辅酶Ａ还原酶（ｆｅｒｕｌｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、对羟基肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ρ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌｃｏｅｎ－ｚｙｍｅＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、肉桂酰辅酶Ａ：ＮＡＤＰＨ还原酶（ｃｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡ：ＮＡＤＰＨｒｅｄｕｃｔａｓｅ）。ＣＣＲ是催化木质素特异途径的第一个限速酶（Ｌａｃｏｍｂｅｅｔａｌ．，１９９７），可能对木质素生物合成途径的碳流具有潜在的调控作用。２０世纪７０年代以来国内外从酶的提取与性质、基因克隆和转基因等方面对ＣＣＲ的研究取得了一些进展，并逐渐成为植物木质素合成途径研究的一个热点，但关于ＣＣＲ研究进展至今国内外尚缺少专门的综述性报道。本文就ＣＣＲ的地位、ＣＣＲ的酶学特性、ＣＣＲ基因相关的性质以及ＣＣＲ基因在造纸林木工程、作物品质改良和植被保护研究中的应用前景进行了综述。

即４ＣＬ（４－羟基肉桂酰辅酶Ａ连接酶）的产物４－羟基肉桂酰辅酶Ａ直接作为底物，先后经过ＣＣＲ和ＣＡＤ等的催化反应而形成（图１）。

而Ｇ－木质素和Ｓ－木质素的合成更为复杂，所涉及的酶更多。４－羟基肉桂酰辅酶Ａ先要经过ＨＣＴ（羟基肉桂酸转移酶）、Ｃ３Ｈ（对香豆酸３－羟化酶）、ＣＣｏＡＯＭＴ（咖啡酰辅酶Ａ甲基转移酶）等的催化反应形成阿魏酰辅酶Ａ以后才被ＣＣＲ和ＣＡＤ催化形成Ｇ－木质素。在ＣＡＤ反应之前或之后经过Ｆ５Ｈ（阿魏酸５－羟化酶）和ＣＯＭＴＩ（咖啡酸／５－羟基阿魏酸－０－甲基转移酶）的连续催化，才可以形成Ｓ－木质素。公共苯丙烷途径的第二个酶即Ｃ４Ｈ（肉桂酸４－羟化酶）的产物４－羟基肉桂酸有可能直接转化成咖啡酸，由ＣＯＭＴＩ、Ｆ５Ｈ催化形成阿魏酸或５－羟基阿魏酸，它们再先后被４ＣＬ、ＣＣＲ和ＣＡＤ所催化，也可以形成Ｇ－木质素或Ｓ－木质素（图１）。

虽然木质素的形成过程涉及到许多酶的参与，而且上述最新假设的木质素生物合成途径比经典假设的途径要复杂（Ｂａｕｃｈｅｒｅｔａｌ．，１９９８；Ｌｉｅｔａｌ．，２０００；Ｈｏｆｆｍａｎｎｅｔａｌ．，２００４），但３种羟基肉桂酸的ＣｏＡ酯均要通过ＣＣＲ完成木质素特异途径的第一步还原反应，生成相应的肉桂醛，所以ＣＣＲ一直被认为是催化木质素单体生物合成途径的第一个特异步骤的酶，此酶可能对木质素生物合成途径的碳流具有潜在的调控作用（Ｌａｃｏｍｂｅｅｔａｌ．，１９９７；Ａｂｂｏｔｔｅｔａｌ．，２００２）。

１木质素单体生物合成途径及ＣＣＲ的地位

苯丙烷复合途径可以产生类黄酮、花青素、木质素、植保素、原花青素（缩合单宁）等次生物质，在植物生长发育、抗病、抗逆反应中起着重要的作用。木质素的生物合成途径位于共公苯丙烷途径的下游，是苯丙烷途径的一个分支途径，与苯丙烷的其它分支途径如类黄酮途径等具有平行地位（图１）。

木质素主要由３种单体聚合而成。由于合成木

２ＣＣＲ的酶学特性

２．１ＣＣＲ的分布

自１９７２年以来，科学家们逐步推断并证明了ＣＣＲ参与木质素的生物合成，并从连翘属、大豆等植物中纯化了ＣＣＲ，研究了有关酶学性质（Ｍａｎｓｅｌｌｅｔ

质素的单体不同，可将木质素分为３种不同的类型：ａｌ．，１９７２；ＥｂｅｌａｎｄＧｒｉｓｅｂａｃｈ，１９７３；Ｓｔ!ｃｋｉｇｔｅｔａｌ．，由紫丁香基丙烷单体聚合而成的紫丁香基木质素１９７３；ＲｈｏｄｅｓａｎｄＷｏｏｌｔｏｒｔｏｎ，１９７４；Ｇｒｏｓｓｅｔａｌ．，（ｓｙｒｉｎｇｙｌｌｉｇｎｉｎ，Ｓ－木质素）、由愈创木基丙烷单体聚１９７３；ＧｒｏｓｓａｎｄＫｒｅｉｔｅｎ，１９７５；Ｗｅｎｇｅｎｍａｙｅｒｅｔａｌ．，合而成的愈创木基木质素（ｇｕａｉａｃｙｌｌｉｇｎｉｎ，Ｇ－木质１９７６）。随着分离纯化的方法不断完善，除连翘和大素）和由对－羟基苯基丙烷单体聚合而成的对－羟基豆外，现已成功地从白杨（Ｓａｒｎｉｅｔａｌ．，１９８４）、桉树苯基木质素（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｌｉｇｎｉｎ，Ｈ－木质素）（魏建（Ｇｏｆｆｎｅｒｅｔａｌ．，１９９４）、云杉（ＬｕｄｅｒｉｔｚａｎｄＧｒｉｓｅｂａｃｈ，华和宋艳如，２００１）。与此对应，这３种木质素单体分１９８１）、绿豆（Ｃｏｌｒａｔｅｔａｌ．，１９９９）等多种植物中分离纯别通过相互类似但又有差异的姊妹途径而合成。这３化得到ＣＣＲ。关于植物器官和组织中ＣＣＲ的分布特个姊妹途径最大的区别是利用的苯丙烷前体物不一点的系统研究不多，在桉树上发现ＣＣＲ主要分布在样，但ＣＣＲ的还原作用和ＣＡＤ（肉桂醇脱氢酶）的脱木质部、厚壁组织中（Ｓａｒｎｉｅｔａｌ．，１９８４）。氢作用是它们都必须经过的关键酶反应步骤。Ｈ－木

的分离纯化及活性测定

质素的合成代表了最简单的木质素合成途径，所涉２．２ＣＣＲ及的酶最少，它利用公共苯丙烷途径的最后一个酶

Ｇｏｆｆｎｅｒ等（１９９４）的分离方法具有一定的代表

植物肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ＣＣＲ）基因的研究进展

ＡｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓｉｎＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＰｌａｎｔＣｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡＲｅｄｕｃｔａｓｅ（ＣＣＲ）Ｇｅｎｅｓ

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图１最新的苯丙烷代谢图，重点显示了不同木质单体的生物合成途径（Ｈｏｆｆｍａｎｎｅｔａｌ．，２００４）

注：通向木质素单体及主要产物的途径用粗箭头显示；双向箭头表示在３－羟基化步骤以后辅酶Ａ（ＣｏＡＳＨ）、奎尼酸盐和莽草酸的循环利用；４ＣＬ：４－羟基肉桂酰辅酶Ａ连接酶；Ｃ３Ｈ：对香豆酸３－羟化酶；Ｃ４Ｈ：肉桂酸４－羟化酶；ＣＡＤ：肉桂醇脱氢酶；ＣＣｏＡＯＭＴ：咖啡酰辅酶Ａ甲基转移酶；ＣＣＲ：肉桂酰ＣｏＡ还原酶；ＣＯＭＴＩ：咖啡酸／５－羟基阿魏酸－Ｏ－甲基转移酶；Ｆ５Ｈ：阿魏酸５－羟化酶；ＨＣＴ：羟基肉桂酸转移酶；ＰＡＬ：苯丙氨酸解氨酶；ＳＡＤ：芥子醇脱氢酶

Ｆｉｇｕｒｅ１Ａｃｕｒｒｅｎｔｖｉｅｗｏｆｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｍａｉｎｌｙｓｈｏｗｉｎｇｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｓｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌｓ

Ｎｏｔｅ：Ｒｏｕｔｅｔｏｌｉｇｎｉｎｓｕｂｕｎｉｔｓａｎｄｍａｊｏｒｐｒｏｄｕｃｔｓｉｓｓｈｏｗｎｉｎｂｏｌｄａｒｒｏｗ；Ｔｈｅｄｏｕｂｌｅ－ｈｅａｄｅｄａｒｒｏｗｓｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｃｏｅｎｚｙｍｅＡ（ＣｏＡＳＨ），ｑｕｉｎａｔｅ，ａｎｄｓｈｉｋｉｍａｔｅｒｅｃｙｃｌｉｎｇａｆｔｅｒｔｈｅ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎｓｔｅｐ；４ＣＬ：４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡｌｉｇａｓｅ；Ｃ３Ｈ：ｐ－ｃｏｕｍａｒａｔｅ３－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｌａｓｅ；Ｃ４Ｈ：Ｃｉｎｎａｍａｔｅ４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；ＣＡＤ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ－ａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＣＣｏＡＯＭＴ：Ｃａｆｆｅｏｙｌ－ＣｏＡＯ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＣＣＲ：Ｃｉｎｎａｍｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＣＯＭＴＩ：Ｃａｆｆｅｉｃ／５－ｈｙｄｒｏｘｙｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄＯ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｆ５Ｈ：Ｆｅｒｕｌａｔｅ５－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；ＨＣＴ：Ｈｙｄｒｏｘ－ｙｃｉｎｎａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＰＡＬ：Ｐｈｅａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ；ＳＡＤ：Ｓｉｎａｐｙｌ－ａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ

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分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

性。分离ＣＣＲ的所有纯化步骤都在４℃条件下进行，计算。桉树ＣＣＲ的理论分子量和等电点与纯化酶的把剥离下来的木质部放入研钵中，加入一定体积的测定值是一致的（Ｌａｃｏｍｂｅｅｔａｌ．，１９９７）。拟南芥的缓冲液，缓冲液中包括１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ７．６）、２％的聚乙二醇（ＰＥＧ）６０００、５ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ）、２％的聚乙烯吡咯烷酮（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＰＶＰ），将这些木质部研磨成匀浆液，充分振荡搅拌３０ｍｉｎ，然后把提取液用两层纱布过滤，得到酶液初提物。用３０％的饱和硫酸铵与酶液初提物一起搅拌混匀１ｈ，１５０００ｒ／ｍｉｎ下高速离心３０ｍｉｎ，把上清液与７０％的饱和硫酸铵溶液一起搅拌混匀１ｈ，１５０００ｒ／ｍｉｎ高速离心３０ｍｉｎ，倒掉上清，把沉淀放进另一种缓冲液１（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液，ｐＨ７．５，５ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ，５％己二酸乙二醇）中

ＡｔＣＣＲ１分子量为３７．５ｋＤ，等电点为６．１，ＡｔＣＣＲ２分

子量为３６．６ｋＤ，等电点为６．０９（Ｌａｕｖｅｒｇｅａｔｅｔａｌ．，２００１）。甘蔗的ＣＣＲ分子量为４０．１ｋＤ，等电点为５．６７（Ｓｅｌｍａｎ－Ｈｏｕｓｅｉｎｅｔａｌ．，１９９９）。黑麦草的ＣＣＲ分子量为３７．４ｋＤ，等电点为６．３４（Ｌａｒｓｅｎ，２００４ｂ）。大麦的ＨｖＣＣＲ分子量为３７．７ｋＤ，等电点为６．１５；而马铃薯的ＳｔＣＣＲ１分子量为３６．５ｋＤ，等电点为７．１（Ｌａｒｓｅｎ，２００４ａ）。至今没有文章明确说明ＣＣＲ有没有信号肽以及亚细胞定位的情况，但ＣＣＲ基因编码蛋白的理论分子量与纯化的ＣＣＲ蛋白的分子量之间是一致的，说明ＣＣＲ是单亚基酶（Ｓａｒｎｉｅｔａｌ．，１９８４），ＣＣＲ蛋

进行悬浮，然后在１００００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ，把上清液白没有剪切性的信号肽，翻译后也没有明显影响分

上ＰＤ１０柱子（柱子要预先在缓冲液１中进行平衡），子量的肽链加工。用洗脱液进行脱盐处理。初步脱盐的酶液抽提物上另外一种柱子，用缓冲液１以１０ｍｌ／ｈ的速度洗脱，得到的酶液产物在３６ｍｌ／ｈ的速度下以浓度梯度为２０￣１．５ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣ１（ｐＨ７．５５，含５ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ和５％乙二醇）进行洗脱，得到比较纯的酶液。

酶活性的测定通过紫外分光光度法，用１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠缓冲液（ｐＨ６．２５）提取，反应液总体积５００μｌ（内含１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠缓冲液（ｐＨ６．２５）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰＨ）、７０μｍｏｌ／Ｌ阿魏酰辅酶Ａ、５￣１００μｌ酶液），在３０℃反应２￣１０ｍｉｎ，测定在３６６ｎｍ的吸光度值。Ａ３６６条件下图像呈线性下降趋势，能够反映ＣＣＲ的活性（Ｇｏｆｆｎｅｒｅｔａｌ．，１９９４）。

关于ＣＣＲ酶提取和测定的其它方法，可以参考文献（Ｇｒｏｓｓｅｔａｌ．，１９７３；ＧｒｏｓｓａｎｄＫｒｅｉｔｅｎ，１９７５；Ｗｅｎｇｅｎｍａｙｅｒｅｔａｌ．，１９７６；Ｓａｒｎｉｅｔａｌ．，１９８４；Ｃｏｌｒａｔｅｔａｌ．，１９９９）的报道。

ＣＣＲ维持活性的最适ｐＨ随着不同来源的植物有差异，大豆的ＣＣＲ的最适ｐＨ值为６．０￣６．２（Ｗｅｎ－ｇｅｎｍａｙｅｒｅｔａｌ．，１９７６），杨树ＣＣＲ在缓冲液中的最适ｐＨ值为６．０￣６．５（Ｓａｒｎｉｅｔａｌ．，１９８４），而连翘ＣＣＲ／ＦＣＲ（ｆｅｒｕｌｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ）在磷酸钾测定缓冲液中的最适ｐＨ值为７．４￣７．８（ＧｒｏｓｓａｎｄＫｒｅｉｔｅｎ，１９７５）。连翘和大豆ＣＣＲ／ＦＣＲ的催化反应不需要二价阳离子作为辅因子，添加ＥＤＴＡ对该酶的活性没有影响，但辅因子ＮＡＤＰＨ不能用ＮＡＤＨ代替，ＣＣＲ酶活性还受到反应产物ＮＡＤＰ＋和ＣｏＡＳＨ的反馈抑制（Ｗｅｎｇｅｎｍａｙｅｒｅｔａｌ．，１９７６；ＧｒｏｓｓａｎｄＫｒｅｉｔｅｎ，１９７５）。

Ｎ－乙基顺丁烯二酰亚胺（Ｎ－ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ，ＮＥＭ）及４－氯汞基苯甲酸盐（４－ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐＣＭＢ）等能和巯基反应的有机物可以不同程度地抑制ＣＣＲ的活性，金属螯合物１，１０－菲罗啉（１，１０－ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ－ｌｉｎｅ）也能不可逆地抑制白杨等植物的ＣＣＲ（Ｓａｒｎｉｅｔａｌ．，１９８４；Ｇｏｆｆｎｅｒｅｔａｌ．，１９９４）。此外，白杨ＣＣＲ的活性还表现出受金属螯合物的抑制，添加Ｚｎ２＋后能够

２．３ＣＣＲ的基本特性

恢复酶活性，这一点与连翘ＣＣＲ不一样。在桉树中

ＣＣＲ的分子量最初是通过对提取的酶液进行电还发现，能与赖氨酸反应的试剂４，４－二异硫氰酸基泳分析来推断的。已报道的ＣＣＲ分子量一般在３０ｋＤ－２，２－１，２－二苯乙烯二磺酸盐（４，４－ｄｉｉｓｏｔｈｉｏ－以上，但随不同来源而稍有差异。桉树的ＣＣＲ分子量ｃｙａｎｏ－２，２－ｓｔｉｌｂｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，ＤＩＤＳ）也能不可逆地

等电点为７．０（Ｇｏｆｆｎｅｒｅｔａｌ．，１９９４），大豆抑制ＣＣＲ的酶活性（Ｇｏｆｆｎｅｒｅｔａｌ．，１９９４）。大约为３８ｋＤ，

的ＣＣＲ分子量也大约为３８ｋＤ（Ｗｅｎｇｅｎｍａｙｅｒｅｔａｌ．，不同植物的ＣＣＲ的米氏常数（Ｋｍ）不同，即使是１９７６）。白杨的ＣＣＲ分子量为３６ｋＤ，等电点为７．５同一植物的ＣＣＲ对不同底物的Ｋｍ也可能不同。桉（Ｓａｒｎｉｅｔａｌ．，１９８４）。云杉的ＣＣＲ分子量大约为３８ｋＤ，树ＣＣＲ对底物对－香豆酰辅酶Ａ（ｐ－ｃｏｕｒｍａｒｏｙｌ等电点为６．２５（ＬｕｄｅｒｉｔｚａｎｄＧｒｉｓｅｂａｃｈ，１９８１）。ＣｏＡ）的Ｋｍ为２８!ｍｏｌ／Ｌ，对阿魏酰辅酶Ａ（ｆｅｒｕｌｏｙｌ－

２０世纪９０年代以来，许多植物完成了ＣＣＲ基ＣｏＡ）的Ｋｍ为３７!ｍｏｌ／Ｌ，对芥子酰辅酶Ａ（ｓｉｎａｐｙｌ－因的克隆，并对编码的ＣＣＲ蛋白的基本特性进行了ＣｏＡ）的Ｋｍ为２８!ｍｏｌ／Ｌ（Ｇｏｆｆｎｅｒｅｔａｌ．，１９９４）。大豆