总RNA提取和电泳实验

总RNA的提取和电泳

一、实验目的和原理

完整的RNA提取和纯化是进行RNA方面的研究工作的前提（Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR等）。在RNA制备过程中，必须注意控制RNA酶的活性，0.1TPC或者RNase Away TM试剂可以有效去除RNA酶，在实验过程中的实验器具和实验用水均需经过DEPC水处理。 二、试剂

1) TRIzol试剂 2) 氯仿

3) 0.1% DEPC水：与5L蒸馏水中加入5 ml DEPC,充分混匀，置37℃过夜，然后高温高压灭菌，分装，4℃保存备用。 4) 75%乙醇：需用DEPC处理水配制，75 ml 100%乙醇中加入DEPC水置总体积为100 ml。

5) PBS缓冲液:称量试剂NaCl 8g，KCl 0.2g ，Na2HPO4 1.42 g，KH2PO4 0.27g 至于1L烧杯中，向烧杯中加入800mL的去离子水，充分混匀，滴加HCl将PH调节至7.4，然后定容为1L，高温高压灭菌后，室温保存。 三、实验步骤（Trizol法提取总RNA） 1. 样品处理：

1) 单层贴壁细胞

直接向直径为3.5cm的培养板中加入1mL TRIzol溶解细

胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。取1mL裂解物移至一个1.5mL离心管中，室温放置5min。或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀，加入相应量的TRIzol。 2) 动物组织

对动物组织进行匀浆处理，在装有新鲜动物肝脏组织匀浆中加入相应体积的预冷 Trizol，每 50-100mg样品加 1ml Trizol，充分混匀。静置 10min，12000rpm，4°C 离心 15min。

2. 加入1/5体积（200μL）的氯仿，剧烈颠倒混匀15-30s，勿剧烈涡旋震荡，室温静置2-3min可见分层，如此重复几次使液体充分分层。12000 ×g，4℃离心 15 min。离心后，溶液分为 有机相和水相，中间有一层蛋白质层，RNA 在上层水相层。 3. 小心吸取上层水相（约600μL），移至一个新的Ep管中，注意不要吸出中间，该层富含蛋白质。

4. 加入 1/2 Trizol（500μL） 体积的预冷的异丙醇，混匀后室温静置 10 min。12000×g，4℃，离心 10 min 后，可见沉淀。 5. 小心地彻底弃上清。将离心管置于离心机中离心数秒，再用移液器小心吸去残留液体。

6. 加入1倍（1mL） Trizol 体积的 75%乙醇，来回颠倒混匀，使沉淀悬浮，以确保洗涤干净。

7. 7500×g，4℃离心 5min。小心地弃上清。若沉淀量较大可洗涤2次。将离心管置于离心机中离心数秒，再小心地用移液器吸取

残留液体。若看不见沉淀，则不要用移液器吸。

8. 室温静置 5-15 min 以干燥 RNA 沉淀。用10-20μL无 RNA 酶的纯水溶解 RNA 沉淀。-80℃保存备用。 四、RNA浓度的测定

取5μLRNA溶液，加DEPC水稀释至60μL,混匀，以DEPC水为空白对照，读取紫外分光光度计260nm波长下的光密度值。按以下公式计算RNA浓度：RNA浓度（μg/μL）=A260×40×60/5/1000 五、RNA纯度的测定

取5μLRNA溶液，加DEPC水稀释至60μL,混匀，以DEPC水为空白对照，读取紫外分光光度计260nm、280nm波长下的光密度值计算A260/A280的比值，比值为1.8-2.0说明纯度比较高，低于1.8说明受蛋白质的污染，如大于2.0，说明受其他物质的污染。 六、RNA完整性鉴定

主要有两种方法验证：非变性凝胶电泳和甲醛变性凝胶电泳。 琼脂糖凝胶电泳：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15 min)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。28S rRNA的量约为18S rRNA的两倍，说明RNA的完整性较好。