饲料中营养物质或有毒有害物质检测方法的研究进展

某种饲料中营养物质或有毒有害物质检测方法的研究进展

Some kind of feed nutrients or toxic substances detection methods research

作者：李常银 Author: Lee Silver

地址：四川农业大学动物医学院

Address: College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University, 邮编：652000 Code: 652 000

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某种饲料中营养物质或有毒有害物质检测方法的研究进展

摘要:饲料是发展养殖业得物质基础，饲料成本占养殖生产成本的70%左右，掌握饲料中的营养物质或有毒有害物质检测方法是取得生产效益和经济效益的关键环节之一。随着饲料工业、动物营养科学和分析检测技术研究的不断深入发展，对分析测试的项目和分析手段也要求越来越严格，为了确保动物食品安全生产，在加入WTO后，我们更注重了饲料安全性与世界接轨，在这方面已经受到了国家和各级政府的高度重视。为了加强对饲料、饲料添加剂的管理，提高饲料、饲料添加剂的质量，保障动物产品质量安全，维护公众健康，应对绿色壁垒已成为工业制造业发展进程中一场持久而艰巨的拉距战，而有毒有害限用物质的检测便是其中至关重要的一环。本文主要介绍饲料中营养物质或有毒有害物质的检测方法，总结有毒有害物质的研究进程。文章引用了他人的研究方法，主要说明不同方法的研究进展，以检测有毒有害物质为重点，饲料中营养物质的测定为辅助，把握了当代科技技术的研究方法，有毒有害物质包括了天然有毒有害物质和人工合成的有机药物，这些药物不仅对动物有很大的影响，还对人体有危害作用，所以说掌握饲料中有毒有害物质的研究有益于我们的身体健康。

关键词:表关代谢能；蛋白代谢率；毒害作用；饲料；有毒有害物质;检测方法; 进展 1. 饲料中蛋白质参假的测定

1.1饲料中添加三聚氰胺定性鉴定和定量分析

1．1．1测定饲料中添加三聚氰胺定性的步骤：建立模型测定光谱→设置参数→建立和检验模型→分析样品→测定未知样品→调用模型→分析结果① 1．2 饲料中三聚氰胺的检测方法 1.2．1定性检测

1.2．1．1氨基酸分析方法

对于鱼粉等蛋白质原料中氨基酸的判定，可以从氨基酸总量和平衡性进行分析。对于纯化的蛋白质，在水解过程中氨基酸残基结合水分子成为游离的氨基酸，氨基酸总量大于蛋白质的总量。但是，在进行氨基酸分析时，一般是采用酸水解的方法对蛋白质水解后再进行分析，而在水解过程中部分氨基酸如色氨酸、苯丙氨酸等被破坏，使氨基酸总量下降。因此，对于一般的鱼粉和其他蛋白质原料的氨基酸分析结果，要求氨基酸总量为蛋白质质量的90％以上，能够达到95％以上为最好。缺点是对于掺人不同处理的羽毛粉、猪蹄角粉、血粉等蛋白质原料，单从氨基酸总量和氨基酸平衡性方面是难以进行分析和判定的。 1.2．1．2 离体消化率测定方法

常规离体率、国标中消化率测定方法是经过酶水解后进行过滤、离心，测定残渣中的蛋白质含量，再通过消化前、后样品中蛋白质含量的差异计算的，测定的是溶解于消化液中的所有含氮物质的量。因此若在蛋白质原料中掺人的非蛋白质物质能够溶解或部分溶解，则测定的消化率就会高于真实结果。优点是当蛋白质原料中掺人不同处理的羽毛粉、猪蹄角粉、血粉时，可以采用这种方法进行鉴定。 1.2．2定量检测

1.2．2．1 高效液相色谱法②

该方法的原理是试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，将提取液离心后经混合型阳离子交

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摘自四川农业大学动物营养研究所《饲料分析及质量检测技术》课件 作者：吴彩梅、吴秀群、贾刚等 ②

2007年农业行业标准NY／T1372—2007《饲料中三聚氰氨的测定》，本标准引用于此处。

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换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。样品前处理：准确称取0．25 g粉碎均匀的样品于50 mL有盖的塑料离心管中，加入乙腈和水各25 mL，在旋涡混合器中混匀1 min后超声20 min，再在旋涡混合器中混匀1 rain，离心5 min后取上清液过0．2汕m滤膜。吸取滤液0．25 mL并加人0．1 mol·L。的盐酸0．75 mL，混匀后过0．2 I．zm滤膜，在高效液相色谱仪上进行测定。标准液制备：称取三聚氰胺标准品0．1 g，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解，稀释至刻度，得1 000斗g·mL。1标准储备液；准确吸取储备液10 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得100 txg·mL_标准中间液；分别吸取中间液5、10、25、50 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容， 即得浓度分别为5、10、25、50 I．Lg·mL。的标准液。液相色谱：色谱柱：EclipseXDB—C。(150 mm×4．6 mm，5．0 I．zm)；流动相：乙腈：缓冲液=85：15，其中缓冲液为10 mol·L。1柠檬酸和10 mol·L‘1庚烷磺酸钠的混合液，pH=3．0；流速：0．8 mL·min。1；进样体积：10¨L；柱温：25 oC；检测波长：240nm保留时间：约4．5 min；运行时间：10 min。计算公式：X=C·V·n／m式中：x一试样中三聚氰胺的含量／mg·kg一；c一标准曲线上查得的试样中三聚氰胺的浓度／txg·mL。；V一净化后加入的甲醇溶液体积／mL；m一一试样质量，g；n一稀释倍数。该操作复杂但精密，可以用于测定低浓度的三聚氢胺。①① 1.2．2．2 气相色谱一质谱检测法

该方法的原理是净化后的洗脱液用氮气吹干，用N，O一双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，以气相色谱一质谱联用仪进行定性和定量测定。根据液相的定量结果将洗脱液浓度稀释至为0．5 Ixg·mL～。分别吸取稀释液0．5 mL用氮气吹干，加入吡啶250汕L和衍生试剂250 IxL，加盖，混匀，70℃反应30 min，同时吸取0．5 Ixg·mL。的标准溶液0．5 mL做同步衍生，用气相色谱一质谱联用仪确证。

此外，还有很多方法可以用来检测饲料中的三聚氢胺。 1.3 尿素、铵盐、硝酸盐-亚硝酸盐的快速定性检测 操作：粗称2g上述脱脂样品于试管中，加10mL蒸馏水，用涡旋混合器混合10～15s，静置10min，取用上清液测非蛋白氮。

1.3.1 尿素的快速定性检测。

1.3.1.1 先加6～8滴上清液到白色点滴板上，然后加2～3滴0.1%溴百里酚兰和4～5滴0.4%尿素酶到白色点滴板上，观察颜色变化情况。若为阳性反应结果呈蓝色，阳性最低检测限是0.25%。

1.3.1.2 取试样5g左右，置于一张干净的滤纸上，再加入5g左右的生豆粉，搅拌均匀，用蒸馏水润湿，滴入数滴甲酚红试剂，让其反应3～5min，若有尿素存在即显出红色，且散开得像蜘蛛网似的，无尿素则显出黄色。 1.3.2 铵盐快速定性检测

加6～8滴上清液到点滴板上，然后滴加2～3滴奈斯勒试剂，观察颜色变化结果。阳性反应的结果：开始为黄色，逐渐变为深桔色，一会就变灰色，若只出现深桔色、基本不变色或由黄色直接变为灰色或很快变为灰色，则是阴性。最低检测限是0.1%。 1.3.3 硝酸盐-亚硝酸盐的快速定性检测

加6～8滴上清液到点滴板上，然后加2～3滴0.5%二苯胺，观察颜色变化结果。阳性反应的结果：在点滴板中间是深蓝色，最低检测限是0.05%。 1.4 脲醛聚合物的快速定性检测

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本方法也可称为三聚氰酸法

饲料博览·技术版2D∞2009年第5期

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1.4.1 样品过45目筛， 加6～8滴0.5%变色酸到点滴板上， 取一些筛下样品也加到点滴板上，往点滴板上再加0.5%变色酸，观察颜色变化结果。阳性反应的结果：在5～10min内，出现蓝紫色，缺点是最低检测限是0.15%，动物性原料必须脱脂才能进行测定。

1.4.2 称3g样品加到50mL带盖离心管中，加35mL煮沸的20% NaOH溶液，用涡旋混合器混匀，静置大约5min，倒掉上清液，留下底部沉淀，加35mL蒸馏水，混合，静置5min，倒掉上清液，反复洗3～4次，洗到沉淀无色（白到灰色），用蒸馏水将沉淀转移到10mL的试管中，吸出试管内大部分水，仅留1cm高的水。加1mL 0.5%变色酸，混匀，再观察颜色。阳性反应的结果：蓝紫色，缺点是最低检测限是0.25%，并且仅动物性原料。

以上的方法中对非蛋白质含氮化合物快速检测方法结合了感官检测、显微镜检测、物理、化学和生物学检测，各种检测方法相辅相成。在实践中经过多次和传统的标准常规检测方法对比，上述检测方法更简便、快速、经济、实用、检测结果直观、技术易掌握，甚至非专业人员都可掌握，这就是很好的优点。缺点是精确度不都是很高。 2.1 饲料中有毒有害物质的有机氯类农药。

如六六六、滴滴涕等，沙门氏菌对人和动物有致病力。饲料霉变主要由黄曲霉属、青霉属、交链孢霉属、镰刀霉属等引起。霉菌不仅仅会影响饲料质量，影响动物正常生长，最严重的是产生毒素，引起动物中毒。饲料添加剂包括维生素、微量元素、氨基酸和药物添加剂等，大多数来自自然产物和人工合成，部分具有毒副作用，在添加量过大时，对动物产生毒害作用。铜中毒时，大量铜在肝脏蓄积，抑制多种酶的活性，引起肝坏死。违禁药物包括激素类、安定类和抗生素类药物。如盐酸克伦特罗，又称瘦肉精，主要添加在育肥猪饲料中，能够提高猪的瘦肉率。添加后一方面是引起猪只体代谢异常，影响猪只的正常生长，严重的出现死亡；另一方面是在动物产品中残留，人食用后，会造成二次中毒，危害人体健康。 2．2 快速检测方法的应用

现在饲料中有机农药的检验的手段与方法多种多样，检测仪器也越来越灵敏，检测方法的检测限量也越来越低。快速检测法因其检测所需的时间短、仪器要求简单、结果判别容易人员技术要求低、对环境没有特别的要求。一般的快速检测产品都可满足饲料检测的要求，得到检测人员的一致认同，同时解决了基层检测的技术困难，既快速又简便，还可明显降低检测成本。

2.2.1 酶联免疫检测法（ELISA）

ELISA principle is to use immunology antigen antibody specificity combination of enzyme catalysis and high efficiency through chemical method will plant horseradish peroxidase (HRP) and test object union, form enzyme coupling objects. Enzyme league immune detection kit is a lot of variety, the variety of dipsticks not too much, main can meet essence, chloromycetin, lean lean, hormone, stability and sulfonamides common drug residue detection.（ELISA 法原理是利用免疫学抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用，通过化学方法将植物辣根过氧化物酶（HRP）与检测物结合，形成酶偶联物。酶联免疫检测试剂盒已经有很多的品种，试纸条的品种还不算太多，主要可满足瘦肉精、氯霉素、磺胺、激素、安定等常见药物残留的检测。） 2.2 免疫金技术

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摘自Determination of residues of zearalanol, β-zearalanol, α-zearalenol, β-zearalenol,

zearalanone and zearalenone in foodstuffs of animal origin - LC-MS/MS method GB/T 21982-2008

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