考研分子生物学常见试题-

相互作用——蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成.

⑵反式作用因子与顺式作用元件的结合:反式作用因子被激活后,即可识别并结合上游启动子元件

和增强子中的保守性序列,对基因转录起调节作用.

⑶反式作用因子的作用方式——成环,扭曲,滑动,Oozing.

⑷反式作用因子的组合式调控作用:每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或

抑制作用,但反式作用因子对基因调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用.

(四),真核生物转录后水平的调控机制 答

1),5,端加帽和3,端多聚腺苷酸化的调控意义:5,端加帽和3,端多聚腺苷酸化是保持

mRNA

稳定的一个重要因素,它至少保证mRNA在转录过程中不被降解. (2),mRNA选择性剪接对基因表达调控的作用 (3),mRNA运输的控制 (五),受体的特点

答:1,高度专一性;2,高度亲和性;3,可逆性;4,可饱和性;5,特定的作用模式 (六),表皮生长因子介导的信号传导途径

答:表皮生长因子受体是一个典型的蛋白酪氨酸激酶受体,这个信号转导途径的主要步骤是: 1, 受体二聚化的形成及其磷酸化:表皮生长因子与受体的结合使受体发生二聚化,从而改变 受体构象,使蛋白酪氨酸激酶活性增强,受体自身的几个蛋白酪氨酸残基在激酶的作用下发生磷酸 化.

2, 募集接头蛋白Grb2:表皮生长因子受体自身被磷酸化后,不仅其激酶活性增强,而且其构 象发生变化,从而适合与含SH2结构域的蛋白分子相结合.Grb2是作为接头蛋白结合到受体上.

3, 调控分子SOS的活化:SOS含有可与SH3结构域相结合的富含脯氨酸基序,当Grb2结合 到磷酸化的表皮生长因子受体后,它的两个SH3结构域即可结合SOS,使之活化.

4, 低分子量G蛋白Ras的活化:SOS可促进Ras释放GDP,结合GTP的反应,使Ras激活. 活化的Ras作用其下游分子Raf,使之活化.Raf是MAPK级联反应的第一个分子,由此启动了MAPK

的三级激活过程.

5, MAPK的级联激活:Raf是一种MAPKKK,它作用于MEK,使之磷酸化而激活,活化的 MEK在作用于MAPK家族的ERK1,使之磷酸化激活由此完成了三级激活.

6, 转录因子的磷酸化及转录调控作用:活化的ERK可以转至细胞核内,使某些转录调控因子 发生磷酸化,从而影响基因的转录. (七),cAMP信号转导途径

答:1,组成:胞外信息分子(主要是胰高血糖素,肾上腺素和促肾上腺皮质激素),受体,G蛋白, AC,cAMP , PKA. 2,途径:

信号分子与受体结合,引起受体构象变化 受体活化G蛋白

活化后的G蛋白激活腺苷酸环化酶(AC)

AC 催化ATP生成cAMP

cAMP 活化PKA,PKA使目标蛋白磷酸化,调节代谢酶的活性或调节基因的表达 (八),IP3-Ca2+信号途径:

信号分子与受体结合,引起受体构象变化 受体活化G蛋白

活化后的G蛋白激活PLC

PLC 水解PIP2生成IP3 和DG IP3 使钙通道打开,细胞内Ca2+升高

Ca2+ 与CaM结合,激活Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶 Ca2+ -CaM依赖的蛋白激酶使目标蛋白磷酸化. (九),分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件 答:(1),常用的工具酶

1, 限制性核酸内切酶:是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核

酸水解酶.

2, DNA连接酶:将两段DNA分子拼接起来的酶. 3, DNA聚合酶:催化单核苷酸链延伸.

4, 逆转录酶:依赖于RNA的DNA聚合酶,这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶,产物 DNA又称互补DNA.

5, 末端脱氧核糖核酸转移酶:将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端. 6, 碱性磷酸酶:催化去除DNA,RNA等的5磷酸基团.

7, 依赖DNA的RNA聚合酶:识别特异性启动子,RNA转录. (2),良好载体的条件

1,必须有自身的复制子;2,载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点,即多克隆位点,以 供外源DNA插入;3,载体应具有可供选择的遗传标志,以区别阳性重组子和阴性重组子;4,载体

分子必须有足够的容量;5,可通过特定的方法导入细胞;6,对于表达载体还应具备与宿主细胞相

适应的启动子,前导顺序,增强子,加尾信号等DNA调控元件. (十),蓝-白筛选的原理

答:某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段,在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一

段含多种单一限制酶位点的DNA序列.这些位点上如果没有克隆外源性DN**段,在质粒被导入

lac-的大肠杆菌后,质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达,与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补,产

生有活性的半乳糖苷酶,加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后,出现蓝色的菌落.如果在多克隆位

点上插入外源DN**段,将使lac Z基因灭活,不能生成半乳糖苷酶,结果菌落出现白色.由于这 种颜色标志,重组克隆和非重组克隆的区分一目了然. (十一)SANGER双脱氧链终止法的原理

答:DNA链中核苷酸以3',5'-磷酸二酯键连接,合成DNA所用的底物是 2'-脱氧核苷三磷酸. 2',3'ddNTP与普通dNTP不同,它们在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基.在DNA聚合酶作用 下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中,但由于没有3'羟基,不能同后续的dNTP形成磷酸

二酯键,因此,正在延伸的DNA链不能继续延伸.在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入

少量的一种ddNTP,链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争,产物是一系列的核苷酸链,

其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离.在4组独立酶反应中分别采用4种不同的

ddNTP,结果将产生4组寡核苷酸,它们将分别终止于模板链的A,C,G或T位置. (十二),核酸分子杂交的原理

答:具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)碱基互补配对

结合,重新形成双链;在这一过程中,核酸分子经历了变性和复性的变化,以及在复性过程中个分

子间键的形成和断裂.杂交的双方是待测核酸和已知序列. (十三),影响杂交的因素

答:1,核酸分子的浓度和长度:核酸浓度越大,复性速度越快.探针长度应控制在50-300个碱基 对为好.

2,温度:温度过高不利于复性,而温度过低,少数碱基配对形成的局部双链不易解离,适宜的温度

是较TM值低25度.

3,离子强度:在低离子强度下,核酸杂交非常缓慢,随着离子强度的增加,杂交反应率增加.高浓 度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应

液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度.

4,杂交液中的甲酰胺:甲酰胺能降低核酸杂交的TM值.它有以下优点:在低温下探针更稳定;能

更好地保留非共价结合的核酸.

5,核酸分子的复杂性:是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度.两个不同基因组DNA变性后

的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性(即DNA中的碱基数).

6,非特异性杂交反应:在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭,以减少其对探针的非特异性

吸附作用.

(十四),探针的种类和优缺点

答:1,cDNA探针:通过逆转录获得cDNA后,将其克隆于适当的克隆载体,通过扩增重组质粒而 使cDNA得到大量的扩增.提取质粒后分离纯化作为探针使用.它是目前应用最为广泛的一种探针.

2,基因组探针:从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后,大量扩增,纯化, 切取插入片段,分离纯化为探针.

3,寡核苷酸探针:根据已知的核酸顺序,采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针.

4,RNA探针:采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针. (十五),探针的标记法

答:1,缺口平移法:此法是利用适当浓度的DNase Ⅰ在DNA双链上随机切割单链,造成单链切口.

切口处产生一个5末端和3末端,3末端就可以作为引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下,以

互补的DNA单链为摸板,依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上,合成新的DNA单链;同时

DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除,新合成链不断延伸,

从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代.

2,随机引物法:随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物.对于

任何一个用作探针的DN**段,随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合,起到

DNA合成引物的作用.将这些引物与变性的DNA单链结合后,以4种dNTP(其中一种是标记物

标记的dNTP)为底物,合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针.

3,PCR标记法:在PCR反应底物中,将一种dNTP换成标记物标记的dNTP, 这样标记的dNTP 就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上. 4,末端标记法:只是将DN**段的一端进行标记. (十六),PCR的基本原理 答

CR是在试管中进行的DNA复制反应,基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理,

以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质,人为地控制体外合成系统的温度,以

促使双链DNA变成单链,单链DNA与人工合成的引物退火,然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原

料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA.PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的.需

要重复进行DNA模板解链,引物与模板DNA结合,DNA聚合酶催化新生DNA的合成,即高温变

性,低温退火,中温延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环,此循环的反复进行,就可使目的DNA

得以迅速扩增.DNA模板变性:模板双链DNA 单链DNA,94℃.退火:引物+单链DNA 杂交 链,引物的Tm值.引物的延伸:温度至70 ℃左右, Taq DNA聚合酶以4种dNTP为原料,以目 的DNA为模板,催化以引物3'末端为起点的5'→3'DNA链延伸反应,形成新生DNA链.新 合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR,就是如此反复循环,使目的

DNA得到高效快速扩增.

(十七),PCR引物设计的基本要求

答:1,引物长度一般为15～30个核苷酸.过短影响PCR的特异性,过长会提高相应退火温度,使 延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成.

2,引物的碱基尽可能随机,避免出现嘌呤,嘧啶碱基堆积现象.3'端不应有连续3个G和C.否 则会使引物和模板错误配对.G+C含量一般占45% -55%.3'端和5'端引物具有相似的Tm值,Tm

值计算公式:Tm=4(G+C)+ 2(A+T)

3,引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构.引物的连续互补序列,一般不超过3bp.