GST（谷胱甘肽转硫酶）测定

GST（谷胱甘肽转硫酶）测定

原理：GST（谷胱甘肽转硫酶）测定具有催化还原性谷胱甘肽GSH与2，4 二硝基苯CDNB结合的能力，其结合产物的光吸收峰值波长为340nm,通过测定340nm处吸光度上升速率，即可计算出GST的活力单位。反应式为： C6H3(NO2)2Cl+GSH →C6H3(NO2)2SG+H+Cl

+

-

实验仪器：分光光度计

实验试剂：

1） 0.1mol/l 磷酸盐缓冲液

PH 6.5（配制见p331）

2) 10m mol/l 还原型谷胱甘肽(GSH)：用前临时配制，15.35mg GSH 溶于少量磷酸盐缓冲液，定容于5.0ml

3) 1.25 mmol/l CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)：称取25.35mg，溶于5.0ml无水乙醇，加磷酸盐缓冲液定容至100ml，室温下可用一周

实验步骤：

取样品，精确称量后（约取0.05g）,加1.5mlPBS冰上研磨，离心，收集上清 酶活测定反应体系（参照孟师兄） 试剂

总反应（ml）

0.05

非酶反应(ml)

0.05 0.4 0.55 ------

GSH(10m mol/l)

CDNB(1.25 mmol/l) 0.4 PBS(0.1mol/l) 0.45 样品液 0.1 混匀后测定0，1，2，3，4，5min处340nm的吸光值

(初步估计要做6个样，每个样做3个平行。药品消耗大概： GSH 1.8ml, CDNB 24.4ml

GST蛋白浓度测定 （1） 标准曲线绘制 试管： 1mg/ml标准蛋白溶液： 双蒸水;

0 0

PBS 18ml)

1 0.01 0.09

2 0.02 0.08

3 0.03 0.07

4 0.04 0.06

5 6 0.05 0.06 0.05 0.04

0.1

向各管分别加入3ml的考马斯亮蓝，测OD595（595nm为GST染色后的特征吸收峰）

结果计算：

1) 计算酶反应的A340值：为总反应测定所得的（A340）总与非酶反应的（A340）非之差，即（A340）酶=（A340）总—（A340）非

2） 根据不同时间测定的（A340）酶，计算酶促反应每分钟的平均变化值△（A340）/min 3) 样品中酶的比活力按下式计算：

GST(U/mg)= △A/minⅹ(10V总/(εd V样))= △A/minⅹ（10/(9.6ⅹ10ⅹ1)）ⅹ(3/0.1)= △A/minⅹ3125

ε:产物在340nm处摩尔吸光系数为9.6ⅹ103M-1cm-1

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10:摩尔分子换算成非摩尔分子 d:比色皿光径（cm） V总：测定总体积（ml） V样：所用样品体积（ml）

以下因素可导致误差：

1 CDNB在水中溶解度较低，在测定体系中仅达到亚饱和水平 2 随时间的延长，逐渐失去良好的线性关系

Notes：

DTNB溶解度很小，PH对溶解非常重要。要保证10mM/L的溶解度，磷酸盐缓冲液在配制的时候要准确。

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