第二章临床生物化学实验室基本技术与管理 - 3 - 图文

[定量]

吸取DNA原液 μl，用ddH2O稀释至 ml，在紫外分光光度计上测定A260nm及A280nm，计算A260nm/A280nm比值及DNA浓度。一般以A260nm/280nm≥1.8为标准。 A260nm/A280nm若〈1.6，提示有蛋白质或酚污染，应进一步纯化。

[计算]

DNA浓度（μl/ml）=A260nm×50×稀释倍数×1/光径

*1OD值相当于50μg/ml dsDNA，40μg/ml ssDNA或RNA，2Oμg/ml寡核苷酸。

[试剂及其作用]

1.裂解液（Homogenization buffer）: 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA 10mol/L NaCl

EDTA:抑制DNA酶活性

2.苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform):是表面变性剂(有机溶剂),是非极性分子,H20是极性分子。

当蛋白质水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白分子之间的H20分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性,经过离心,变性蛋白的密度比H2O密度大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚、氯仿有机溶剂比重更大，留在最下层。

酚的变性作用大，但酚与H2O有一定程度互溶，大约10-15% 的H20溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA。

氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相互互溶，不会带走DNA，所以在抽提过程中混合使用效果最好。由于酚与氯仿是互溶的，氯仿可以带走残余的酚。

因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA 的损失。

用Tris调节pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定，在中性与酸性（pH5-7）条件下，RNA比DNA更容易游离到水相中；而在碱性条件下，DNA比RNA更容易游离到水相，所以可获RNA含量较少的DNA样品。 保存在冰箱中的酚容易被空气氧化而变成粉红色（ ），这样酚容易降解DNA，一般不可使用。为防止酚的氧化，可加入巯基乙醇、8-羟基喹啉至终浓度0.1%，用Tris PH 8.0 水溶液饱和后的酚最好分装在棕色瓶中，上面覆盖一层Tris pH8.0缓冲液，隔绝空气，保存于-20℃冰箱中。

3.氯仿-异戊醇（Isoamyl-alcohol）：能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白质及下层有机溶剂相维持稳定。 4.冰无水乙醇（Absolute ethonal）和70%乙醇(70% Ethonal):：

? 无水乙醇优点：①极性低，可以与任何比例的H20溶液混溶；②乙醇与核酸不会引起任何化学反应，对

DNA很安全；③乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失去水而易于聚合；④冰点低，-20℃不会结冰；⑤可除去残余的氯仿。

? 低温条件下分子运动大大减少，DNA易于聚合沉淀。

? 70%乙醇洗涤可去除残余的盐离子，盐离子的存在会使之不易溶解，并可抑制酶反应。

5.TE 缓冲液 （TE Buffer）： 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA

? 缓冲对Tris-HCl不存在金属离子的干扰作用（如转化试验中Ca++） ? EDTA能稳定 DNA的活性。

6.20%SDS（十二烷基磺酸钠）：是离子型表面活性剂，主要功能：①溶解细胞膜蛋白而破坏细胞膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与核蛋白形成复合物

7.10mg/ml蛋白酶K(Protase K)：分解蛋白质，破坏细胞膜

8.10mg/mlRNA酶(RNase)：分解RNA

9.5mol/L NaCl：

pH为8的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子间的同性电荷相斥力，易于相反聚合而形成DNA钠盐沉淀。

[器材]

1.高速组织捣碎器 2.离心管 3.移液管 4.钝粗口滴管 5.离心机 6.移液器 7.塑料吸嘴 8.水浴箱 9.紫外分析仪

[注意事项]

1.处死动物取出所用脏器后应尽快放入液氮中,以免DNase引起DNA降解。在纯化过程中要加核酸酶抑制剂(eg.EDTA),以防DNA自身降解。

2.组织要尽量研磨得细一点，颗粒太大细胞裂解不彻底，在随后得保温过程中会导致DNA得严重降解。

3.真核细胞DNA分子量很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此操作条件要缓和，摇动速度不要过快，溶液转移次数要尽量减少。

4.在纯化过程中去除蛋白质、多糖等杂质时，特别要注意把蛋白质除净。 5.由于酚腐蚀性较强，摇动抽提时应戴一次性手套。