分子生物学总结[1]

第一章 基因与基因组 一、基因与基因组特点(重点)

1. Gene ：a gene includes the entire nucleic acid sequence necessary for the expression of its product (peptide or RNA). 2. Genome(基因组):细胞内所携带的全部遗传信息DNA的总和。 3. C值(C-value): 单倍体DNA所包含的全部DNA量。

4. C值矛盾(C-value Paradox)：物种的C值和它进化复杂性之间没有严格的对应关系。 5. 真核生物基因组的特点： （1）基因组较大

（2）往往有很多染色体，多复制起始位点(ori)

（3）DNA与蛋白质结合，形成核小体(nucleosome) ，再缠绕成染色质chromatin （染色体chromosome ） （4）转录和翻译在时间和空间上是分隔的。 （5）转录产物为单顺反子（mono-cistron）

（6）有可移动的DNA序列

（7）有大量的重复序列、基因家族(gene family)、不连续基因(discontinuous gene) （真核生物基因组三大特点） 6.真核生物基因组的序列类型:高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列。

7.基因家族（gene family）：基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因。 产生机理（理解）：不对等交换、几种基因家族：Alu基因家族、rRNA基因家族 、 组蛋白基因家族、珠蛋白基因家族 疾病： Thalassemia(地中海贫血)

8.珠蛋白基因家族血红蛋白分子是珠蛋白的四聚体?α2β2，α型亚基基因在16号染色体上，β型亚基基因在11号染色体上，珠蛋白基因以基因家族的形式排列。

9.基因簇（gene cluster）：同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个基因簇。

10.假基因(pseudogene)：具有与功能基因相似的序列, 却不具正常功能的基因。

11.不连续基因(discontinuous gene) 或断裂基因（split gene）:基因的编码序列在DNA分子上是不连续的,为不编码的序列所隔开。

证据（理解）：R环结构、限制性内切酶分析 12.外显子(Exon) ：真核细胞基因DNA中的编码序 列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。

13.内含子(Intron) ：真核细胞基因DNA中的非编码序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪切掉而不翻译。 14.外显子与内含子的连接区：（1）内含子的两端序列之间没有广泛的同源性

（2）类型II基因内含子两端有保守区，是RNA剪接的信号序列 15.外显子与内含子的可变调控：

组成性剪接(constiutive splicing)：一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA。 选择性剪接(alternative splicing)：同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同mRNA。 16.内含子的特点：并不是所有真核基因一定有内含子；

同一基因家族中，外显子在进化中一直比较保守，而内含子变化迅速，差异较大； 不同的基因内含子的数量和长度不同；

内含子与外显子间的连接处有特殊的序列； 一个基因的内含子可以是另一个基因的外显子。

二、基因组学

1.基因组学：以基因组分析为手段，研究基因组的结构组成、时序表达模式和功能，并提供有关生物物种及其细胞功能进化信息的一门学科。 （1）根据研究的重点分：结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学。结构基因组学目的是建立高分辨的遗传图谱、物理图谱、转录图谱和序列图谱。 （2）基因功能研究方法 : 同源性分析

RNAi ：RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA引起的基因沉默现象(gene silencing) 。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。

基因敲除：如果通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因的动物称为基因敲除动物。目前基因敲除小鼠是应用最广泛的动物模型之一。

转基因动物模型：指应用转基因技术培育出的携带外源基因的动物。 基因转染细胞模型 2.遗传标记：（1）形态学标记（2）细胞遗传标记（3）生化与免疫遗传标记

（4）分子遗传标记（※）：是一种新的以DNA多态性为基础的遗传标记.

随着分子生物学的发展，相继建立了RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多种分子遗传标记检测技术，开创了遗传标记研究的新阶段。

3.分子遗传标记的基本原理：

（1）RFLP（限制性片段长度多态性 ）：即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。 原理：利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小不等、数量不同的分子片段，

经电泳分离，通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜 (尼龙膜或硝酸纤维素膜)上，

然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片段进行杂交。不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得RFLP谱带表现出不同程度的多态性.

（2）TRS：串联重复序列标：有两类:小卫星和微卫星，两者具有高度的变异性。

（3）SNP：单核苷酸多态性：是指染色体上的某个存在单个碱基的变化，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等。 4.什么是人类基因组计划，它包含了哪些内容？请你评价一下人类基因组计划（HGMP）完成的科学意义。 （ ※ ） 答：于20世纪80年代提出的，由国际合作组织包括有美、英、日、中、德、法等国参加进行了人体基因作图，测定人体23对染色体由3×109核苷酸组成的全部DNA序列，于2000年完成了人类基因组“工作框架图”。2001年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。其研究内容还包括创建计算机分析管理系统，检验相关的伦理、法律及社会问题，进而通过转录物组学和蛋白质组学等相关技术对基因表达谱、基因突变进行分析，可获得与疾病相关基因的信息。 主要任务：四张图——物理图、 转录图、遗传图 、序列图

科学意义：（1）确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。 （2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。

（3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。

（4）研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。 （5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。

（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。

（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。 （8）研究染色体和个体之间的多态性。

第二章、蛋白质组与蛋白质组学

第一节、蛋白质组与蛋白质组学的定义

1.蛋白质组：一个基因组在特定细胞所表达的全部蛋白质。

2.蛋白质组学：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 3.功能蛋白质组学：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。

第二节 蛋白质组学的产生与发展（了解） 第三节 蛋白质组及其质点的分离与分析 分析鉴定（※） （掌握基本原理）

（一）Western印迹技术 原理：将经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至固相支持体上，以针对特定蛋白质的抗体作为探针，与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位进行特异性反应，结合上的抗体可用二抗检测。用于测定特定蛋白质的大小和含量 基本操作步骤： 蛋白样品的制备——SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳——蛋白质的电转移——蛋白质与抗体的结合反应——目标蛋白质的显示

（二）免疫荧光法原理：将待检的目的蛋白作为抗原，固定在载玻片上，先加上针对目的蛋白的抗体(第一抗体)进行反应，再加上针对第一抗体的荧光素标记抗体(第二抗体)进行反应，称作间接免疫荧光法。如果将荧光素标记在第一抗体上，则不用再加第二抗体，称作直接免疫荧光法。

（三）免疫沉淀技术 原理：利用一种可离心沉淀的抗体结合蛋白(如Protein A, Protein G等)，将抗原-抗体复合物从蛋白混合溶液中分离，进行定量或定性研究。 步骤：（1）将抗体加入蛋白混合溶液，使之与相应抗原结合； ? （2）加入固定的抗体结合蛋白 (如: Protein A-琼脂糖珠)；

? （3）经离心后，与Protein A结合的抗原-抗体复合物便可沉淀 ； ? （4）将样品变性后即可获得游离的抗原蛋白 ；

（四）二维凝胶电泳（2-DE) 原理：基于等电点与分子量分离蛋白质 第一相：等电聚焦凝胶电泳（根据蛋白质电荷差异） 第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（根据蛋白质分子量差异）

（五） 质谱（MS）法 基本原理：样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（质荷比，m/e）的差异确定分子量。

（六）蛋白芯片(protein chip)技术 基于蛋白质表面化学及质谱检测的高通量蛋白质分析技术。将一系列“诱饵”蛋白以阵列方式固定在经过特殊处理的底板上，然后将其与待分析的样品杂交，只有那些和“诱饵”结合的蛋白才被保留在芯片上。其实质是酶联免疫吸附测定。 （七） 其它方法

第四节 蛋白质相互作用的研究

（一）蛋白质-蛋白质相互作用的形式 1 蛋白质亚基聚合：构像改变；四级结构 2 交叉聚合：同工酶（LDH） 3 分子识别：（如抗原-抗体） 生物大分子间特异性、专一性的识别和结合 构像互补或构像变化

化学基团相互间足够的结合力

4 分子自我装配：大分子的相互识别和结合

5 多酶复合体：多种酶相互结合形成一种新的结构。 （二）蛋白质之间的相互作用力 蛋白质内部：肽键

蛋白质间：非共价键（氢键、范德华力、疏水键、离子键）

2.、噬菌体展示（※） 基本原理：在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。 噬菌体展示技术（Phage Display techniques，PDT）：

研究基因工程产品蛋白质间相互作用的方法。主要采用抗体基因文库的构建及随机多肽基因文库的构建和筛选。前者主要筛选基因工程抗体，后者筛选随机多肽药物。 3、生物传感芯片质谱 4、定点诱变技术

蛋白质-核酸（※）

（一）凝胶滞后试验（※）基本原理是蛋白质可以与放射性同位素标记的DNA结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的DNA在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后，可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质。 基本步骤：（1） 对含有特异结合位点的DNA片段进行末端标记； ? （2）进行DNA和蛋白质的结合反应；

? （3）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、干胶及放射自显影；

（二）滤膜结合： 利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链DNA，但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的DNA片段与游离DNA片段分离开。

（三）甲基化干扰（※）基本原理：利用硫酸二甲酯(DMS)使DNA分子中的嘌呤碱基G与A发生甲基化，被甲基化修饰的G和A，会干扰DNA结合蛋白与所在部位的DNA结合；

甲基化的探针可被化学试剂哌啶特异地切割，并经电泳分离，由于未结合蛋白的DNA可在随机修饰的位点被切割，而有结合蛋白的DNA在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可获得蛋白质与核酸定位结合的信息。 基本步骤：（1）将待测双链DNA片段中的一条单链的一端用放射性核素标记 ?（2）甲基化修饰DNA探针，并使之与DNA结合蛋白反应；

?（3）按电泳迁移率将游离DNA探针和DNA-蛋白质复合物分开，并回收 ?（4）分别用哌啶切割后在测序聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影

（四）DNaseⅠ足纹（※）基本原理： DNase Ⅰ可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，而结合有蛋白质的DNA免于DNaseⅠ的水解。

主要步骤：1. 将待测双链DNA片段中的一条单链的一端用放射性核素标记； 2. 加入待测蛋白质，使之与末端标记的DNA形成复合物；

3.加入适量的DNaseI进行部分消化，使DNA断裂为相差一个核苷酸的不同片段；这一反应中，DNaseI的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！

4.标本经变性后在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影，使之出现以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带

如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。

（五）Southwestern 印迹（※）：一种核酸-蛋白质杂交实验，用于鉴定蛋白质与DNA的特异性结合和确定结合蛋白质的分子量。

基本原理：待测的蛋白质样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后由电印迹转移至硝酸纤维素膜上，然后加入经放射性核素标记的特定DNA片断(探针)，在相应的缓冲液中进行DNA与蛋白质的杂交,洗膜后进行放射自显影。根据标记信号的有无，即可判断待测样品中是否存在与探针DNA结合的蛋白，以及结合蛋白质的分子量。 基本步骤：蛋白质杂交 SDS-PAGE 转移至NC膜或Nylon膜 加入同位素标记的DNA片段作探针 缓慢复性、封闭、预杂交 TBE缓冲液中DNA蛋白质杂交 多次洗膜 放射自显影

第五节 蛋白质数据库及其应用

二、原核生物的复制

过程：双链的解开——RNA引物的合成——DNA链的延长——切除引物，填补缺口，连接相邻的DNA片断——切除和修复错配碱基。

三、真核生物的复制

真核生物和原核生物DNA复制的不同点：