从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤(精)

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从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤 提取DNA需要的仪器和试剂： ⑴ 1.5ml 离心管

⑵ 移液管: 1000ul, 200ul, 40ul 各一支和移液管尖头: 100-1000ul, 1-200ul 各一盒 ⑶ 微型滤柱（备用） ⑷ 小型旋转混合器一台

⑸ 小型离心机: 可放入1.5ml 离心管和2ml收集管o . ⑹ 恒温水浴

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⑺ 电冰箱: -20 C, 4 C ⑻ 无水乙醇(自备) ⑼ 70% 乙醇(自备)

⑽ 利普生DNA提取试剂盒。内含: ⑴ 裂解液1 ⑵ 裂解液2 ⑶消化液 ⑷纯化液

⑸弥散液 ⑹蛋白酶K ⑺ 带钩细玻棒一盒 ⑻ 微型滤柱若干。

提取DNA前注意：

⑴ 使血样品内容物达到室温（15 – 25 C ）。

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⑵ 预热水浴到58 C， 为步骤3作准备。

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⑶ 置弥散液于58 C内，为步骤4或步骤7作准备。 ⑷ 所有的离心步骤均在室温下进行。 ⑸ lml全血可提得15-60ug DNA。

一．从1ml全血或体液中提取DNA的步骤：

⑴ 裂解1： 取1ml全血，血桨，血清，淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中，加入400ul裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为8000rpm，1min.。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。重复此裂解步骤一次，这次是加入1ml裂解液1。 最后用移液管吸净所有上层液弃去, 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。

⑵ 裂解2: 在上面离心管中加入1ml裂解液2。上下翻转，务必使沉淀物分散， 旋转脉动15秒后放入离心机中离心，8000rpm，1 min.。 倒掉上清液，可见离心管底部有微量淡红色沉淀。重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入1ml裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。

⑶ 消化： 吸取蛋白酶K 10ul ( = 0.2mg )加入到上面的离心管中，用移液管尖头反复吹打， 使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后， 加入320ul消化液，上下翻转离心管， 务必使沉淀物分散于消化液中。放入58 o C水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。 ⑷ 纯化：在上面的消化液体中加入110ul纯化液， 上下翻转离心管几下后， 离

心，速率为15000rpm, 1min， 把上清液吸出放入到装有1000ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转10次， 可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到100ul 70%乙醇中耒回漂洗20次，钩出DNA，

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在空气中凉干一下后放入到100ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4 C，过夜， 使之充分弥散后使用。提取完毕。

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如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA弥散液放在58 C水浴中，保温30分钟, 用手指拍打离心管子，使DNA弥散后使用。提取完毕

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⑸ 收集：(在DNA极少量， 不能用带钩玻璃棒挑起的情况下) 把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中， 滤器放入离心机内，离心: 8000rpm , 1 min.. DNA便附着在滤漠上，弃去滤液，把滤柱放回收集管上。 ⑹ 吸取200ul 70%乙醇于滤柱内，离心8000rpm ，1min， 弃去滤液。把滤柱放回收集管上，再离心 15000rpm ，1 min.. 使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。

⑺ 回收DNA: 把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml 离心管中。 吸取

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100ul 已温热到58 C的弥散液，轻轻放入滤膜的表面， 保温58 C静置10分钟。 离心 8000rpm ，1 min.，DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。

附：如从2ml全血中提出取DNA，方法和步骤与从1ml全血一样，只是在步骤

⑷ 纯化之前，把两个1ml全血的消化液管内容物合并后，加入220ul纯化液，上下翻转离心管几下后， 离心，速率为15000rpm, 1min， 把上清液吸出放入到装有1800ul无水乙醇的2ml管中，轻轻上下翻转10次， 可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到200ul 70%乙醇中耒回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干一下后放入到100ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4 o C，过夜， 使之充分弥散后使用。提取完毕。

如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA弥散液放在58 C水浴中，保温30

分钟, 用手指拍打离心管子，使DNA弥散后使用。提取完毕

二． 从200ul全血或体液中提取基因组DNA的操作步骤

⑴裂解1： 取200ul全血，血桨，血清或淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中，加入200ul的裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为14000rpm，1 min.。倒掉上层液，可见离心管底部有微量沉淀。重复此裂解步骤一次，这次也是加200ul裂解液1。最后用移液管吸净所有上清液弃去, 以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液1。 ⑵裂解2: 在上面离心管中加入200ul的裂解液2。上下翻转，务必使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，14000rpm，1 min.。 倒掉上清液，重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入200ul裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液2。

⑶ 消化：吸取蛋白酶K 5ul ( = 0.1mg )加入到上面的离心管中，用移液管尖头反

复吹打， 使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后， 加入85ul消化液，上下翻转离心管， 务必使沉淀物分散于消化液中。放入到58 Co 水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。

⑷ 纯化：在上面的消化液体中加入30ul纯化液， 上下翻转离心管几下后， 离心，速率为14000rpm, 1min， 把上清液吸出放入到装有240ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转10次， 可见溶液稍有混浊就是絮状DNA析出。 ⑸ 收集：把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中， 滤器放入离心机内离心，离心速率 8000rpm , 1 min.. DNA便附着在滤漠上，弃去滤液，把柱滤器放回收集管上。

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⑹ 吸取50ul 70%乙醇于滤柱内，离心800rpm，1min，弃去滤液。把滤柱放回收集管上，再离心 15000rpm ，1 min.. 使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。 ⑺ 回收DNA: 把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml 离心管中。 吸取

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50ul 已温热到58 C的弥散液，轻轻放入滤膜的表面， 滤器在水浴58 C保温 10分钟。 离心 8000rpm ，1 min.，DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml 离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。

附：从100ul全血或体液中提取基因组DNA

⑴裂解1： 取100ul全血，血桨，血清或淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中，加入100ul的裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为14000rpm，1 min.。倒掉上层液，可见离心管底部有微量沉淀。重复此裂解步骤一次，这次也是加100ul裂解液1。最后用移液管吸净所有上清液弃去, 以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液1。 ⑵裂解2: 在上面离心管中加入100ul的裂解液2。上下翻转，务必使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，14000rpm，1 min.。 倒掉上清液，重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入100ul裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液2。

⑶ 消化：吸取蛋白酶K 5ul ( = 0.1mg )加入到上面的离心管中，用移液管尖头反

复吹打， 使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后， 加入60ul消化液，上下翻转离心管， 务必使沉淀物分散于消化液中。放入到58 Co 水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。

⑷ 纯化：在上面的消化液体中加入20ul纯化液， 上下翻转离心管几下后， 离心，速率为14000rpm, 1min， 把上清液吸出放入到装有160ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转10次， 可见溶液稍有混浊就是絮状DNA析出。 ⑸ 收集：把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中， 滤器放入离心机内离心，离心速率 8000rpm , 1 min.. DNA便附着在滤漠上，弃去滤液，把柱滤器放回收集管上。

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⑹ 吸取50ul 70%乙醇于滤柱内，离心800rpm，1min，弃去滤液。把滤柱放回收集管上，再离心 15000rpm ，1 min.. 使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。 ⑺ 回收DNA: 把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml 离心管中。 吸取

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50ul 已温热到58 C的弥散液，轻轻放入滤膜的表面， 滤器在水浴58 o C保温 10分钟。 离心 8000rpm ，1 min.，DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml 离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。

三．从10ml全血中提取基因组DNA的操作步骤

设备要求：离心机能放入50ml的离心管。由于离心速率低，因而离心时间长一些。 ⑴裂解1： 取10ml抗凝的全血放入到50ml的离心管中，加入10ml裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，在振摇机中振摇10分钟, 放入离心机中离心, 离心速率为2200rpm , 10min.. 可见离心管底部有血色沉淀. 倒掉上层液，重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入10ml裂解液1。 最后用移液管吸净所有上清液弃去, 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。

⑵裂解2: 在上面离心管中加入10ml裂解液2。在振摇机中振摇10分钟, 务必使沉淀物分散, 放入离心机中离心, 离心速率为2200rpm , 10 min.. 可见离心管底部有少量灰色沉淀. 倒掉上层液, 留下沉淀.。重复此提取步骤一次，这次仍然是加入10ml裂解液2。 最后用移液管吸净所有上清液弃去, 以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。

⑶ 消化： 吸取蛋白酶K 100ul ( = 2mg )加入到上面的离心管中，用移液管尖头

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反复吹打， 使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后， 加入1.6ml消化液，振摇3

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分钟, 放入58 C水浴中消化1小时。消化其间，要取出离心管用手拍打一下，帮助内容物均匀消化。最后可见澄明的消化液体。

⑷ 纯化：在上面的消化液体中加入600ul纯化液， 混匀后， 离心，速率为

2800rpm, 15min， 把上清液吸出放入到装有5ml无水乙醇的带盖的管中，轻轻上下翻转10次， 可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到1000ul的 70%乙醇中耒回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干一下后放入到500ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4 o C，过夜， 使之充分弥散。提取完毕。

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如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA弥散液放在58 C水浴中，保温30分钟, 用手指拍打离心管子，使DNA弥散后使用。提取完毕。

附：如从5ml全血中提取DNA，只需按比例减少各步骤的试剂用量。

四．从口腔两颊刮物提取DNA的操作步骤

DNA的浓度一般是3-23ug/ml, OD值为1.7-1.9。

⑴ 裂解1: 吸取600ul PBS 到1.5ml离心管中, 剪入刮颊刷. 旋转脉动15秒. 加入400ul裂解液1. 旋转脉动15秒后放入离心机中离心, 8000rpm , 1 min.. 倒掉上层液。重复此提取步骤一次，这次是加入1000ul裂解液1。 最后用移液管吸净所有上清液弃去, 以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液1。

⑵ 裂解2: 在上面离心管中加入1000ul裂解液2. 旋转脉动15次后放入离心机中离心, 8000rpm , 1 min.. 可见离心管底部有微量沉淀. 倒掉上层清液。重复此裂解步骤一次，这次仍是加入1000ul裂解液2。 最后用移液管吸净所有上清液弃去, 以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液2。刮刷留在离心管内。 ⑶ 消化: 吸取20ul 蛋白酶液( = 0.4mg)加入到上面的离心管中, 旋转脉动一下,

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再加入160ul消化液, 又旋转脉动一下后, 放入58 C水浴中消化15分钟. 取出后可见澄清的消化液。离心8000rpm , 20秒，把盖上的液滴回落到管中. 然后轻轻取出刮刷去掉.

⑷ 纯化: 加入60ul纯化液到上面离心管中，旋转脉动一下, 放入离心机中离心，15000rpm, 1min。 把上清液吸出放入到240ul无水乙醇中 轻轻上下翻转10次, 可见云状DNA析出, 并浮于液面..

⑸ 收集: 把上液倒入微型过滤器中, 滤器放入离心机内 离心: 8000rpm , 1min..

DNA便附着在滤漠上. 弃去收集管中的滤液。

⑹ 吸取50ul 70%.乙醇于滤柱内. 离心 8000rpm , 1 min. 弃去收集管中的滤液。再次离心,离心速率为15000rpm , 1 min.，使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。

⑺ 回收DNA： 把上面附着DNA的滤柱放在一个干净的1.5ml离心管中. 吸取

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100ul 弥散液轻轻放入滤膜的表面(弥散液事先要温热到58 C, 弥散效果更好), 静置10分钟. 离心 8000rpm , 1 min. 含DNA的弥散液便滤入到干净的1.5ml 离心管中。提取完毕。