ELISA操作流程

ELISA操作流程

（一）、基本操作流程

方法一 双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）

1. 包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。

2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；

3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；

4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度； 5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）； 6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min； 7. 洗板：同步骤2； 8. 加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时； 9. 洗板：同步骤2；

10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。

11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。

12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处测OD值。检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。

方法二 间接法（用于检测未知抗体）

1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；

2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；

3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；

4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度； 5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）； 6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min； 7. 洗板：同步骤2；

8. 加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书； 9. 洗板：同步骤2；

10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。

11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。

12. 结果判定：裸眼观察结果或用酶标仪测OD值，有色产物的生成量＝抗体量。

(二) 、ELISA常用的四种方法 1．直接法测定抗原

将抗原吸附在载体表面；

加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；

加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗原量。 2．间接法测定抗体

将抗原吸附于固相载体表面；

加待检抗体, 形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体（抗抗体）；

加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗体量。 3．双抗体夹心法测定抗原

将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗体复合物;

加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);

加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗原量。 4. 竞争法测定抗原

将抗体吸附在固相载体表面; 加入酶标抗原和待测抗原； 加入底物；

结果判定：对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关。