利多卡因通过抑制NF-κB的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤 - 图文

利多卡因通过抑制NF-κB的活化减轻大鼠内毒素性

肺损伤

徐州医学院附属医院麻醉科，江苏 徐州 221002

封光 刘苏 王光磊 刘功俭*

[摘要] 目的：探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制。方

法： SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-κB和胞浆IκBα的表达，ELISA检测血清TNF-α及IL-6的水平，观察大鼠肺组织病理变化。结果：大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织核内NF-κB的表达明显增多，血清TNF-α及IL-6的水平明显升高，胞浆IκBα表达显著减少，病理切片示肺组织结构破坏严重。应用利多卡因后，与LPS组相比，核内NF-κB的表达明显减少，胞浆中IκBα表达显著增加，血清中TNF-α及IL-6的水平也明显降低，肺组织结构的破坏有明显减轻。结论：应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-κB的活化和TNF-α、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-κB的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-κB活化的抑制可能与其抑制IκBα的降解有关。

Summary

Background and Objectives: Lidocaine has been reported to attenuate the inflammatory response in addition to its anesthetic activity, but the mechanisms are

poorly understood. The objective of this study is to determine if Lidocaine prior to endotoxemia diminishes pulmonary dysfunction by blocking the NF-kappa B activation. Methods: Rats were assigned to: 1) control (0.9% sodium chloride); 2) LPS; 3) LPS +lido1mg/kg; 4) LPS +lido2mg/kg; 5) LPS +lido4mg/kg. LPS and LPS+lido4mg/kg groups were subjected to 1h、3h、6h and 12h time point. To investigate the activation of NF-kappa B, the expression of NF-kappa B in the nuclear and I kappa B alpha in the cytosol were analyzed by western blot. The concentration of TNF-alpha and IL-6 in serum was detected by ELISA. The pathologic changes of lung were observed using HE staining. Results: After i.p. injection of LPS, the expression of NF-kappa B in the nuclear extracts was significantly increased and I kappa B alpha in the cytosol extracts was markedly decreased. The concentration of TNF-alpha and IL-6 in serum was increased. Pathological examination showed that the normal structure of lung was destroyed badly. However Lidocaine reversed above results. Conclusion: Lidocaine attenuates LPS-induced lung injury via mechanisms involving inhibiting NF-kappa B activation and cytokines release, which implies Lidocaine may be as a potential anti-inflammatory agent in endotoxemia.

利多卡因通过抑制NF-κB的活化减轻大鼠内毒素性

肺损伤

[摘要] 目的：探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制。方法：

SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-κB和胞浆IκBα的表达，ELISA检测血清TNF-α及IL-6的水平，观察大鼠肺组织病理变化。结果：大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织核内NF-κB的表达明显增多，血清TNF-α及IL-6的水平明显升高，胞浆IκBα表达显著减少，病理切片示肺组织结构破坏严重。应用利多卡因后，与LPS组相比，核内NF-κB的表达明显减少，胞浆中IκBα表达显著增加，血清中TNF-α及IL-6的水平也明显降低，肺组织结构的破坏有明显减轻。结论：应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-κB的活化和TNF-α、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-κB的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-κB活化的抑制可能与其抑制IκBα的降解有关。

[关键词]：利多卡因；核因子-κB；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6；内毒

素；肺损伤

急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由严重感染、创伤和体克等多种病因所致的弥漫性肺实质损伤，其在分子水平上表现为众多促炎性细胞因子、粘附分子的过度表达，伴有多种炎症介质的产生。上述炎症形成级联反应，导致肺组织广泛损害，并累及诸多肺外器官，其中，核因子-κB（NF-κB）在调控炎症介质的基因表达上起着关键作用。多种炎症介质基因的启动子和增强子中含有κB位点，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等。活化的NF-κB可调控上述介质基因的表达。最近的研究证明酰胺类局麻药利多卡因有着显著的抗炎特性[1,2,3]，因此本实验建立大鼠内毒素性肺损伤模型，探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制[4-6]。

材料与方法

实验动物及主要试剂：雄性SD大鼠（由徐州医学院实验动物中心提供）250－300g，LPS（E. Coli 0127:B8）购自sigma公司，NF-κB p65 多克隆抗体， IκBα（NF-κB阻遏蛋白）多克隆抗体（Santa Cruz公司），TNF-α及IL-6酶联免疫（ELISA）试剂盒（美国R&D公司），利多卡因（第二军医大学朝晖制药厂），HE染液（江苏海门碧云天公司）。

SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。参照Sabrina M. Heidemann的实验[7]，采用腹腔注射LPS 8mg/kg（5mg/ml）制作内毒素性肺损伤模型，control组注射同体积的生理盐水。LPS +lido组在注射腹腔注射内毒素前10min，尾静脉注射利多卡因4mg/kg（10mg/ml），而LPS组和control组给予同体积的生理盐水。按分组规定的时间点，10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，取出肺组织。右肺下叶，-80℃冻存，用于Western印迹分析，左肺上叶做石蜡切片用于HE染色病理切片。

1、肺组织石蜡切片的制备：各组实验大鼠分别在相应的时间点，采用 10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，经4％多聚甲醛心脏灌注固定后，取左肺上叶，浸泡固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成4 ?m厚的连续石蜡切片。

2、蛋白质印迹(Western印迹)检测：从液氮中取出肺组织，加1.5 ml Buffer A (含10 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 30 mM ?-phosphoglycerol, 1 mM Na3VO4, 1 mM benzamidine and enzyme inhibitors: 0.5 mM PMSF, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml pepstatin A and 1 mM PNPP)。用电动匀浆器高速匀浆（10秒×6次），加入10%的NP-40 90 ?l，剧烈振荡30 S，800 g×15 min离心，上清液为胞浆部分。后在沉淀物中加入500 ?l Buffer B (20 mM HEPES, pH 7.9, 20% glycerol, 0.42 M NaCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT and enzyme inhibitors: 0.5 mM PMSF, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml pepstatin A and 1 mM PNPP)，4℃转摇30min，12,000 g×15 min离心，取上清为