年产6000吨木聚糖酶发酵车间的设计

(2-6)

其中（2-5）是 TCA 循环的简化方程，（2-6）描述了三羧酸循环过程中细胞物质的生成。

呼吸链中提供大量的能量转换，见下式：

（2-7）

甘油代谢过程中产生的 ATP 一部分用于细胞生长过程的能量消耗，另一部分用于细胞自身生命的维持，甘油代谢过程中，细胞物质主要在 G3P 糖酵解过程和三羧酸循环中合成。

2.1.2甲醇代谢途径

图 2.2 是简化的甲醇期甲醇的代谢途径，甲醇首先被醇氧化酶（AOX）氧化成甲醛和过氧化氢。甲醛随后进入两条代谢途径，小部分进入分解代谢，大部分进入合成代谢。在分解代谢中，甲醛首先被甲醛脱氢酶（FLD1p）氧化为甲酸盐，并进一步被甲酸盐脱氢酶（FDH）氧化为二氧化碳，同时以电子 NADH 的形式释放能量，同时也避免了细胞内部甲醇积累过多而产生毒害作用（Sibirny et al., 1990）。在合成代谢中，甲醛在二羟基丙酮合成酶的作用下与 5 磷木棉糖结合生成三磷酸甘油醛（GAP），GAP 随后进入糖酵解和 TCA 循环。本文假定甲醇期的细胞物质主要从 GAP 和 TCA 循环中转化合成。消耗的甲醇进入分解代谢的比例为 φ。对于 φ 的大小，文献报道结论不一。Veenhuis et al.（1983）认为，甲醇代谢过程所需的能量主要来自分解代谢，因此进入分解代谢途径的甲醛较多；而 Sibirny et al.（1990）认为，分解代谢的作用主要是保护细胞不因大量的甲醇残留而中毒的，代谢过程中需要的能量主要来自合成代谢，故进入合成代谢途径的甲醛较多。由于碳源主要是在合成代谢途径中消耗的，大量的能量应来自于合成代谢。在本文的实验中，甲醇期比生长速率的控制在较低水平（0.003-0.0085 h-1），甲醇的残留浓度几乎为零，因此不需要进行过多的分解代谢以避免较高浓度的甲醇残留，故此本文φ 值设定在较低的0.25。不可否认，φ 的取值未必精确，还需要进一步的实验结果来修正。幸运地是，φ 引起的误差可以由模型中的其它参数来弥补。

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图2.2 毕赤酵母甲醇代谢途径

在此可以列出甲醇期的化学计量平衡方程： 甲醇首先被氧化为甲醛：

（2-8）

甲醛在分解代谢中被氧化为甲酸欲，最终转变为二氧化碳：

(2-9)

甲醛在合成代谢过程中被磷酸化。击要指出的是，生成1摩尔的GAP击要消耗3摩尔的甲醛(Lin Cereghino and Cregg, 2000: Lueers et al., 1998)。

（2-10）

GAP酵解生成内酮酸以及合成细胞物质的方程分别见下式：

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（2-11）

（2-12）

内酮酸被氧化为乙酞辅酶A

甲醇期乙酞辅酶A以后的代谢途径以及呼吸链中的代谢途径与甘油期相同，前面有所介绍，这不过多重复，主要反应有：

（2-4） （2-5）

(2-6)

同前所述。

2.2巴斯德毕赤酵母发酵生产木聚糖酶过程中的主要影响因素 2.2.1碳源的影响

甘油是菌体生长阶段普遍采用的碳源,通过补料加入培养基,其浓度过低或

过高会限制或抑制菌体生长,因此,需要优化初始甘油浓度,选择有效的补料方式。葡萄糖也可作为碳源,虽效果不如甘油,但性价比却优于甘油, 以葡萄糖代替甘油将有利于工业化生产。

甲醇是诱导表达阶段的碳源,其浓度(CMeOH )和补料方式是关键。CMeOH过低,会限制菌体生长和诱导强度; CMeOH过高,则对菌体产生毒性。甲醇最佳浓度一般在0. 5% ～3% ( v/v) ,但有些蛋白高于3%],因此,不同蛋白的最佳浓度不同,需通过实验并结合补料策略确定。CMeOH通过补料调节并保持恒定,其检测控制方法有溶氧反馈控制、甲醇离线控制和在线控制,而甲醇在线控制最优。

2.2.2氮源的影响

氨水常作为氮源,并用于调节pH,其释放的NH4浓度对菌体生长、蛋白表达和降解有重要影响。浓度过低,限制菌体生长,并增加蛋白的降解;浓度过高,虽可减少蛋白降解,却会抑制菌体生长和蛋白表达。因此, NH4+浓度需要优化,并采用恒浓度或变浓度法调控。谢静莉等在发酵后期添加(NH4 ) 2 SO4 ,使NH4+浓度维持在150mmol/L以上,蛋白表达量提高58. 8%。采用变浓度法调控NH4+浓度后,既促进菌体生长,提高表达量,又降低蛋白酶降解。

2.2.3基础盐和PTM1微量盐的影响

在表达分泌蛋白时,需降低基础盐浓度。基础盐。浓度过高,会导致菌体死亡,

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并增加蛋白酶释放,增加蛋白降解。Surribas等以电导率反映基础盐浓度,将初始电导率降为30% ,并在诱导过程维持在20%后,菌体死亡率下降。Zhao等将基础盐浓度降为1 /4时,诱导前后菌体死亡率分别降低83. 3%和48. 6% ～59. 2% ,菌体密度增加25% , HAS2IFN2α2b表达量提高92. 0% ,并保持恒定。PTM1 微量盐溶液成分过于复杂,不能高温灭菌,易形成沉淀且价格较高,不利于大规模发酵,可用低浓度的酵母抽提物来替代PTM1 微量盐,简化工艺,也可用麦芽汁来替代,性价比可大幅提高,即简化工艺又降低成本,有利于工业化生产。

2.2.4添加其它物质,降低蛋白酶降解

在培养基中添加VitC、VitE可以减少菌体死亡,减少蛋白酶的分泌;添加蛋白胨或酪蛋白水解物等底物,竞争性抑制蛋白酶活性;添加蛋白酶抑制剂或EDTA,抑制蛋白酶活性, 它们都能降低蛋白酶降解。Xiao等[添加VitC并维持在4～10mmol /L后,菌体死亡率降低65. 4% ,水蛭素降解程度降低30. 2% ,完整蛋白的表达量提高56. 8%。Zhao等在诱导前添加2%大豆胨后, HAS2IFN2α2b只有极轻微的降解。Ayed等添加酪蛋白水解物并维持在0. 1%或EDTA 并维持在10mmol /L后,均能阻止h IFNα2b 的降解,前者使产物保持恒定,后者使表达量提高65%。

2.2.5pH的影响

pH对菌体生长和诱导表达都会产生影响,尤其是诱导时的pH,不仅会影响蛋白表达量和活性,而且会通过影响蛋白酶活性,来改变蛋白的降解程度。如当pH由3升至7时, rHSA的降解逐渐减少。因此,必须选择合适的pH,一般在3. 0～7. 0,而且在不同阶段,应选择不同pH,采用变pH发酵。pH一般是通过补加氨水来调节,若NH4+浓度过高,则改为补加碱来调节。

2.2.6温度的影响

温度升高,有利于生长代谢和蛋白表达,但温度过高反而会使菌体过早

衰老,发酵周期缩短,降低蛋白表达量和活性。因此,必须选择合适的温度,而且在不同阶段,应选择不同的温度,采用变温发酵。菌体生长最适温度为30℃,诱导表达的最适温度应降低,常为20-28℃,尤其是分泌蛋白,低温更有利于表达。

低温可以降低折叠压力,有利于新生肽链的正确折叠;降低菌体死亡率,减少蛋白酶分泌,降低蛋白酶活性;提高AOX酶活性和转录水平,还可以提高蛋白稳定性。

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