油菜PEPase基因的克隆及其对应RNAi载体的构建 - 张银波 - 图文

2005年3月March2005

中国油料作物学报

Chinesejournalofoilcropsciences

第27卷第1期Vo.l27No.1

油菜PEPase基因的克隆

及其对应RNAi载体的构建

张银波,江木兰,胡小加

(中国农业科学院油料作物研究所,农业部油料作物遗传改良重点实验室,湖北武汉430062)

摘要:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶。采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中双4号中扩增出PEPase基因cDNA片段,与已发表的PEPase基因(登录号为D13987)序列同源性为98%。根据RNA干扰(RNAi)目标序列的选取原则选取两段长度约为400bp的DNA序列,分别克隆到RNAi载体pHBM1301中,构建了油菜中对应于PEPase基因的RNAi载体pHBM1301-PEP1和pHBM1301-PEP2。

关键词:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶;RT-PCR;RNAi中图分类号:S565.403.2　文献标识码:A　

文章编号:1007—9084(2005)01—0001—04

　　近年来的研究表明,一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNAinterference,简称RNAi,也译作

RNA干涉)。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术,近年来发展迅速,成为功能基因组研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内,特异性地降解与其序列同源的mRNA,封闭相应内源基因的表达,从反向遗传学的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。它最早在线虫C.elegans上发现,现已被广泛的应用于动物、植

[2]

物和真菌基因的功能分析。在拟南芥中一些参与生长发育和生理代谢的基因如AGAMOUS、CLAV-ATA3、APETALA1、PERIANTHIA和FAD2等被成功的

[3,4]

利用RNAi技术进行了功能抑制。其他植物如烟草

[5]

[1]

质含量与PEPase活性密切相关。在此基础上,陈锦清等提出“底物竞争”假说

[8]

,认为籽粒的主要储藏

物质油脂和蛋白质均来自葡萄糖酵解产物———丙酮酸,两者之间存在着底物竞争,而平衡点取决于两类

物质代谢的关键酶,PEPase和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coenzymeAcarboxylase,简称ACCase)的相对活性。PEPase催化丙酮酸合成草酰乙酸进入蛋白质代谢;ACCase催化丙酮酸合成乙酰辅酶A进入脂肪酸代谢。上述两种酶的相对活性是调控籽粒蛋白质油/脂含量比率的关键酶。

本研究利用RT-PCR技术克隆到了油菜PEP基因片段,并构建了对应于PEPase基因的RNAi载体,以利用RNAi技术抑制油菜PEPase基因的表达,使代谢流偏向油脂合成,从而提高油菜籽粒中的油脂含量并为油菜的功能基因组研究奠定一定的基础。

、水稻

[6]

等都观察到了dsRNA降低目标基因

[7]

mRNA水平的现象,GuiliangTang等还探讨了利用RNAi技术改善植物营养价值的可行性。然而到目前,还未见将RNAi技术应用于油料作物脂肪酸代谢调控的相关报道。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase,简称PEPase)是控制油菜蛋白质油/脂含量比例的一个关键酶。早在20世纪50年代,就有关于油菜蛋白质含量与油脂含量呈高度负相关的报道,80年代末,日本学者杉本博士发现籽粒蛋白

收稿日期:2004—09—06

基金项目:“十五”国家科技攻关重大课题(2004BA520A16-03)

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　酶和试剂　限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶、Ex-Taq酶、4种dNTP和OneStepRT-PCRKit等均购自TaKaRa公司,TRIzol试剂购自Invitrogen公司,OligotexmRNAMiniKit购自QIAGEN公司,DNA纯化试剂盒购自VITAGEN公司,其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

作者简介:张银波(1974—),男,湖北应城人,硕士,从事植物和微生物基因工程研究工作。Tel:86-27-86838791;Fax:86-27-86822291;

E-mail:ybzhang04@yahoo.com。

1.1.2　植物材料、菌株和质粒　甘蓝型油菜(Bras-sicanapusL.)中双4号,由中国农业科学院油料作物研究所提供。大肠杆菌菌株DH5α为本实验室保存,质粒pHBM1301为湖北大学分子微生物与基因工程研究室构建,质粒pMD18-T购自Takara公司。1.2　方法

1.2.1　总RNA的抽提和mRNA的纯化　取适量甘蓝型油菜中双4号种子萌发后2周的叶片,用DEPC处理的ddH2O配制的PBS缓冲液清洗3次,滤干后迅速置于液氮中冻存10min,利用TRIzol试剂抽提其总RNA,OligotexmRNAMiniKit纯化其mRNA,具体实验步骤分别见TRIzol试剂和OligotexmRNAMiniKit的操作手册。

1.2.2　RT-PCR扩增　按OneStepRT-PCRKit操作手册用PE2400PCR仪扩增,根据已发表的PEPase基因(登录号为D13987)序列分别设计下列扩增引物。primer390F:5’GATCGGCCTCTGCAAC-TACTGAATCCG3’,primer787R:5’GATCAAAG-CAGTGTCAACGCGTCTC

3’,

primer1564F:5’

GATCGGCGCGTACATCATCTCA3’,primer1965R:5’GATCCGGCGGCTGAGACAAGA3’,扩增条件:50℃30min,94℃2min;94℃30sec,56℃30sec,72℃1min;30个循环;72℃15min。

1.2.3　DNA的回收、消化、连接和转化　参照相应的试剂盒操作手册和文献[9]进行。

1.2.4　PCR产物的克隆与测序　PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后,连接克隆载体pMD18-T,连接物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组子经鉴定后送上海博亚公司测序。

1.2.5　PEPase基因RNAi载体的构建　回收约0.4kb的PCR扩增产物,经T4DNA聚合酶处理后与用SapI消化好的RNAi载体pHBM1301(图1)连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒得到重组载体

pHBM1301-PEP1和pHBM1301-PEP2,利用PCR方法鉴定重组子。

2　结果与分析

2.1　油菜PEPase基因的克隆及序列分析

抽提甘蓝型油菜中双4号种子萌发后2周叶片的总RNA,甲醛琼脂糖变性胶电泳鉴定其质量(图2),符合要求后分别利用引物对primer390F和primer787R、primer1564F和primer1965R进行RT-PCR,结果均扩增得到约400bp的扩增产物,与预期结果相符(图3),纯化后分别克隆到pMD18-T上,送上海博亚公司测序。测序结果经BLAST分析比对,表明本研究所克隆的两段PEPase基因片段与所报道的油菜PEPase基因相应的序列高度同源。

图2　油菜叶片总RNA质量甲醛变性胶分析检测Fig.2　　AnalysingtheQualityoftotalRNAbyFormaldehydeDenaturalizationAgroseGel

1.引物primer390F和primer787R的扩增产物,RT-PCRproductbyprimer390Fandprimer787R

2.引物primer1564F和primer1965R的扩增产物,RT-PCRproductbyprimer1564Fandprimer1965R3.分子量标记:λDNA/HindIII,Marker:λDNA/HindIII

图3　RT-PCR扩增产物电泳图

Fig.3　　AmplificationofPEPasegene

cDNAFragmentsbyRT-PCR

图1　载体pHBM1301的RNAi结构单元示意图

Fig.1　SchematicDiagramofRNAi

ConstructsofpHBM1301

2.2　油菜PEPase基因RNAi载体的构建及验证

回收PCR扩增出约400bp的目的片段,在12℃、有dGTP存在的情况下用T4DNA聚合酶处

理,纯化后与用SapI消化好的植物RNAi载体pH-BM1301连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,重组质粒命名为pHBM1301-PEP1。以pHBM1301-PEP1的质粒DNA为模板,分别利用引物35S-F(5’-CCTTCAGTTTAGCTTCATGGAGTC-3’)和primer390F、35S-F和primer787R进行PCR扩增,均得到约1.0kb的扩增产物;利用引物primer390F和primer787R进行PCR扩增,又得到约400bp的扩增产物(图4),而以空载体pHBM1301的质粒DNA为模板,利用相同引物则未扩增出相应的产物,均与预期相符。由此可判断质粒pHBM1301-PEP1即为我们所需的对应于PEPase基因的RNAi载体。载体pHBM1301-PEP2的构建和验证同pH-BM1301-PEP1。

而如何构建快捷有效的RNAi载体则是其中最为关键的一步。

本研究中所用载体的RNAi载体(结构单元见

[3,10]

图1)与传统的植物RNAi载体(图5)相比有以下优点:首先,该载体对目标基因片段的克隆只需进行一次连接而且不要求方向性。不论目标基因片段以何种方向连入,利用该载体的双启动子均可以得到对应于目标基因的dsRNA。传统载体对目标基因片段的克隆需进行2次连接,且还要求有方向性,即要求连入的两个相同的基因片段在载体中的位置必须是反向的,否则,得不到对应于目标基因的dsRNA。其次,利用该载体,目标基因片段的连接不用限制性核酸内切酶的切割,从而避免了因基因片段内部存在相应酶切位点而被切断的危险。本载体构建过程中,插入片段的扩增引物5’端加上GATC四个核苷酸,扩增产物利用T4DNA聚合酶的3’到5’的外切酶活性,从片段的两头削出与SapI相匹配的粘端,而直接与用SapI消化好的载体连接,从而避免了限制性核酸内切酶的内部切割问题。而且,该载体可以大规模、高通量地进行RNAi结构单元的构建,利用RNAi库转化植物,从而构建突变体库。

1.以pHBM1301-PEP1质粒DNA为模板,引物35S-F和primer390F的扩增产物,PCRproductof35S-Fandprimer390Fbyplas-midpHBM1301-PEP1DNAtemplate2.以pHBM1301-PEP1质粒DNA为模板,引物35S-F和primer787R的扩增产物,PCRproductof35S-Fandprimer787Rbyplas-midpHBM1301-PEP1DNAtemplate3.以pHBM1301-PEP1质粒DNA为模板,引物primer390F和prim-er787R的扩增产物,PCRproductofprimer390Fandprimer787RbyplasmidpHBM1301-PEP1DNAtemplate4.引物primer390F和primer787R的RT-PCR扩增产物,PCRproductofprimer390Fandprimer787RbyRT-PCR5.以pHBM1301质粒DNA为模板,引物primer390F和primer787R的扩增产物,PCRproductof35S-Fandprimer390FbyplasmidpHBM1301DNAtemplate6.分子量标记:λDNA/HindIII,Marker:λDNA/HindIII

图5　传统植物RNAi载体的RNAi结构单元示意图

Fig.5　　SchematicDiagramofRNAiConstructsoftraditionalvectors

本载体若成功实现其抑制目的基因的功能,则可以为油料作物的基因工程育种开辟新的途径,同时也为油菜的功能基因组研究奠定一定的基础。参考文献:

[1]　FireA,XuS,MontgomeryMK,eta.lPotentandspe-cificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391(6669):806—811.

[2]　VoinnetO.RNAsilencingasaplantimmunesystema-gainstviruses[J].TrendsGenet,2001,17,449—459.[3]　ChuangCF,MeyerowitzEM.Specificandheritablege-neticinterferencebydouble-strandedRNAinArabidop-

图4　重组质粒pHBM1301-PEP1的PCR鉴定电泳图

Fig.4　ConfirmationofRecombinantPlasmidpHBM1301-PEP1byPCR

3　讨论

自1986年人类首次获得转基因植物以来,植物基因工程的研究与应用蓬勃发展。迄今为止,油菜

基因工程育种在整个作物基因工程中一枝独秀,应用前景引人瞩目。而RNAi比反义核酸技术有效,比基因敲除技术简单。因此,将RNAi技术应用于油菜的基因工程育种具有重大的研究和现实意义,

sisthaliana[J].ProcNatlAcadSciUSA,4985—4990.

2000,97,nutritionalvalue:frommechanismtoapplication[J].TrendsinBiotechnology,2004,22(9):463—469.[8]　陈锦清,郎春秀,等.反义PEP基因调空油菜籽粒蛋白

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[7]　GuiliangTang,GadGalil.iUsingRNAitoimproveplant

MolecularcloningofthePEPasegenefromBrassicanapusandtheconstructionofitscorrespondingRNAivectorsZHANGYin-bo,JIANGMu-lan,HUXiao-jia

(OilCropsResearchInstitute,CAAS;KeyLabofGeneticsImprovementforOilCrops,Wuhan430062,China)Abstract:Phosphoenolpyruvatecarboxylase(PEPase)playsanimportantroleinthecontroloftheratiooftheprotein/lipidcontentinrapeseed(Brassicanapus).ThecDNAfragmentofPEPasegenewasclonedfromB.napuszhongshuangNo.4byRT-PCR.Sequenceanalysisofthefragmentsuggestedthatitpossessed98%homologywiththePEPasegene(D14985).Inordertodown-regulatetheexpressionofPEPasegene,two400bpfragmentswereclonedintotheSapIsiteofRNAivectorpHBM1301andtworecombinantplasmidspHBM1301-PEP1andpH-BM1301-PEP2wereobtained.

Keywords:PEPase;RT-PCR;RNAi

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《中国油料作物学报》编辑部