第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体

*M13噬菌体之寄主菌株

应用M13噬菌体载体进行克隆时的寄主菌株有：

JM101，JM105，JM107，JM109，JM110，TG1，TG2，XL1-Blue，XS127，XS101，71/18，KK2186，MV1184，(From Somebrook et al., 1989. P.211)

2．M13克隆体系?-半乳糖苷酶显色反应原理

*M13和相关寄主菌株如JM101。由于它们单独均不能产生有功能活性的?-半乳糖苷酶，因此单独均不能显色。

只有当M13 phage载体和JM101一类菌株一道才能产生完全的有功能活性的?-半乳糖苷酶，因此可以显色。 A．X-gal显色反应原理

具功能活性的?-lac是以四聚体形式存在的，它可将无色的底物X-gal：(X-gal: 吡喃半乳糖苷衍生物)

5-bromo-4chloro-3-indolyl-?-D-galactoside (5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷) 切成半乳糖和深蓝色的底物-靛蓝： 5-bromo-4-chloroindigo

因此，X-gal可以作为检测?-半乳糖苷酶活性的一种有效的指示

剂。

B．顺反子内互补作用或?-互补作用

推理：*使M13体系显色最简单的办法是使之带上一个完整的

lac操纵子，但这样的结果会使M13分子过大而不便于克隆操作。

*所以，应用DNA重组技术构建出只具?-半乳糖苷酶基因一小部分的M13派生载体。这个片段编码?-半乳糖苷酶的氨基末端，即?-肽链。

*通过顺反子内互补测验(intracistronic complementation test)便可检测出这种?肽链的功能活性。

定义：所谓顺反子内互补作用，是指编码同样的多肽链序列但

又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。

举例：

两个lac操纵子突变体：

一个在染色体上 Lac- 一个在F质粒上 Lac-

当两者同处一个细胞内(部分二倍体)，两个lac突变体

互补了，形成Lac+

?互补作用：

顺反子互补也可以多肽形式出现，例如M13克隆体系就是一个典型的例子。

Lac缺失突变lacZ(?M13)简称M15

↓

合成一种缺失了11-41氨基酸的缺陷性的?-半乳糖苷酶，又称M15多肽。

这段缺失使该酶失去了四聚化作用的能力。

遗传标记 lacZ?M15：缺失突变体，缺失lacZ基因中的?-半乳糖苷酶N端部分编码序列。?M15所表达的小肽可以参与?互补。M13 phage的许多寄主菌所携带的F?附加体都有这种缺失的lacZ基因变种。

但是，在体外加入野生型的?-半乳糖苷酶的溴化氰片段

(cyanogens bromide fragment)(2-92氨基酸)就可以使M15多肽的活性得以恢复，重新获得形成四聚体的能力。因此说溴化氰自然补偿了lacZ

基因的M15突变，这种作用叫做?-互补作用：

其中M15蛋白质多肽叫 ?-受体

溴化氰片段叫 ?-给体

M13-JM101互补作用：

实验发现，用一种特定的?-半乳糖苷酶的HindII片段代

替溴化氰片段，同样也可以发生?-互补。 在M13-JM101克隆体系中；

M13噬菌体载体具有lac HindII片段， JM101 F质粒具有M15突变基因。

所以M13-JM101是可以实现?-互补作用的；可形成具功

能活性的?-半乳糖苷酶。

克隆基因活性的调节：

M13载体所携带的HindII片段上具有：

lacI? lac启动子(P) lac操纵位点(O) lacZ?(?-肽链)