灭菌无菌工艺验证指导原则

附件2：D值的测定方法

一般可以采用毛细管暴热计时法测定污染微生物的耐热参数D值，测定主要包括以下几个步骤：

①制样：将产品中的微生物分离，将菌膜或者孢子悬浮液分别放入注射用水或者磷酸盐缓冲液中，采用适宜的设备振动使其分散均匀，制备成浓度约为108个/ml的悬浮液，然后在沸水中加热约10分钟以杀灭可能存在的芽孢繁殖体。

②测定：将上述悬浮液注入适宜长度的毛细管中，使每管的菌量为106个孢子，封口，置于校正过的121℃的油浴中曝热。每隔1-3分钟取出两支毛细管并迅速冷却，制备孢子溶液，培养后计数。

③计算：根据公式lgNt=lgN0-t/D ，其中，N0和Nt分别为零时和曝热t 时间的孢子的浓度。

由以上的D值的测定方法可知，测定所需的仪器并不非常复杂，但需要专业技术人员和经验的积累。在不具备D值测定条件时，可以采用测定污染菌的耐热性来代替。

附件3：生物指示剂用量的确定方法。

① 阴性分数法 根据公式：

F0=L×t，其中L为灭菌温度的灭菌率（Z=10），t为灭菌时间。

SLR=FO/Dbi ，其中SLR为spore log reduction，即孢子对数下降值，Dbi为所选用的生物指示剂的D值。

SLR=lgNO- lgNt ，其中NO为灭菌前容器内初始孢子数，Nt为灭菌后容器内残存孢子数。

lgNt=2.303×lg(n/q) ，其中n为挑战性试验瓶样品总数，q为挑战性试验结果为阴性的瓶数)

可以得到：

lgNO =lgNt +SLR= 2.303×lg(n/q) + FO/Dbi =2.303×lg(n/q) + L×t /Dbi 当湿热灭菌工艺的灭菌温度和灭菌时间确定后，L、t可以确定；生物指示剂确定后，Dbi可以确定；微生物挑战试验方案确定后，n、q可以确定。所以，通过以上的几个公式，可以计算出生物指示剂的用量，即NO。

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需要说明的是，在常规的生产条件下，如采用115℃灭菌30分钟，假定采用的生物指示剂的D值为1，那么，计算得到的生物指示剂的用量为106，这也是微生物挑战试验时常规采用的用量。

② 残存曲线法 根据公式：

FT/Dbi = lgNO +1，其中FT 为T灭菌值，即给定Z（Z=10）值下，灭菌程序在温度T下的等效灭菌时间，FT= F0/L；Dbi为所选用的生物指示剂的D值；NO为灭菌前容器内初始孢子数。

当湿热灭菌工艺的灭菌温度确定后，L可以确定；生物指示剂确定后，Dbi可以确定；当F0设定后，即可计算出生物指示剂的用量，即NO。

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