基础生物学实验教材-学生使用版2011 - 图文

(6) pH7.2磷酸缓冲液洗三次，每次10min。（关键步骤四，对实验结果的影响最大。用新鲜缓

冲液洗2次即可，搅动时要减少样品卷曲和破坏） (7) 0.2％考马斯亮蓝R250染色20～30min。（新鲜染液作用15min即可）

(8) 用蒸馏水洗1～2次（关键步骤五，可以准备两个烧杯或培养皿，分别装入蒸馏水，用小

镊子夹住样品浸入第一份蒸馏水中，迅速搅动几次，洗去所有的染料，再转入另一份蒸馏水中浸泡，装片时再捞出。）。

(9) 将材料捞出置于载玻片上的水滴中，小心展开平整，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察

（评价标准：没有蓝色背景，表明细胞膜处理完全；丝状的骨架蛋白从细胞核延伸到细胞膜，表明细胞质处理得当）。多观察几片材料，选择最满意的一个细胞请老师观察和评分。 五、作业 绘出植物细胞骨架微丝结构图。

实验3 叶绿体的分离制备与观察

一、实验目的

学习分离与纯化叶绿体的方法，了解细胞器分离制备的一般原理和程序。 二、实验原理

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体是比较大的细胞器，在叶肉细胞中含量丰富，用新鲜的植物叶片匀浆后使用普通离心机进行离心也能得到良好分离效果。叶绿体得率可通过检测叶绿素含量来确定。

叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L NaCl或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。同时，叶绿体的酶系对热敏感，在室温下容易失活。如要得到功能完整、能保持其酶系的活性的叶绿体，在实验中所需基本仪器和药品都必须保持在冰箱中，而且整个操作过程都应在0～4℃条件下完成；如果在室温下，要迅速分离和观察。 三、实验仪器、材料和试剂

1、仪器、用具：显微镜、镜油、擦镜纸、载玻片、盖玻片、离心机、瓷研钵、盘式天平、剪

刀、纱布、玻璃漏斗、烧杯、量筒、玻棒、滴管、吸水纸、分光光度计、水浴锅。 2、材料：新鲜的菠菜叶或豌豆叶。 3、试剂：

STN缓冲液： 0.4M蔗糖，0.01M NaCl，0.005M MgCl2 溶于0.05M三羟甲基胺基甲烷（Tris）-HCl缓冲液，调pH7.6。 配制方法：6g Tris,136.9g蔗糖，0.58g NaCl, 0.29g MgCl2加入蒸镏水750ml 混合后用1N HC1调pH至7.6，然后用蒸馏水稀释到1升。 80%丙酮

四、方法与步骤 （一）叶绿体的制备

1． 菠菜或豌豆叶片洗净，吸干表面水滴，贮在4℃冰箱中备用（最好使用浓绿的新鲜叶片）。 2．取10ml分离介质（STN缓冲液）分两次放入研钵中。

2

3．去掉叶柄和主脉，称取5克叶片并把叶片剪成1～2cm小块和介质一起在钵中研磨，磨成

9

匀浆为止（可添加少许石英砂，避免过度匀浆及产生泡沫）。 4．将匀浆液用二层纱布过滤到烧杯中。

5．滤液用1000rpm离心8分钟，弃去沉淀，留上清液。

6．上清液中加入介质5ml，混匀，再以1000rpm离心8分钟，弃去沉淀，留上清液。 7．上清液用2500rpm离心10～20分钟，弃上清液，留下沉淀的叶绿体小球。

8．加入适量（0.2～0.5ml）冷却的STN缓冲液，将沉淀的叶绿体全部悬浮，将叶绿体悬浮液贮存于冰箱中。

9．转移出0.5ml叶绿体悬浮液到另一支干净试管中，在60℃水浴中保持5分钟，然后取出试管，贴上标签再贮存于冰箱中。

10．分别在两张载片上各滴一滴加热和未加热的叶绿体悬浮液，用盖片盖起来，在油镜下观察这两种叶绿体的形态。 （二）检测叶绿素含量

1、 5μl叶绿体悬液与995μl的80％丙酮在微量离心管中混匀。 2、 13 000g，室温离心2min。

3、 取溶液在663nm及645nm处检测吸光值。

4、 计算：叶绿素含量（mg/ml）=(8.02 A663 + 20.2 A645) /5 五、作业

观察经过加热和未加热这两种叶绿体在形态上的区别，并绘出草图。

实验4 植物原生质体的分离和融合

一、实验目的

学习植物原生质体的分离制备与原生质体融合技术。 二、实验原理

植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞。纤维素酶能消化除去细胞壁，从而可从植物组织中分离出大量具有生理活性的原生质体。原生质体可从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官(叶、下胚轴等)获得。但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致。而从单细胞和愈伤组织分离到的原生质体，由于受培养条件的和继代培养的影响，易使细胞间发生遗传和生理差异。所以，从培养的单细胞和愈伤组织中获得的原生质体不是十分理想的材料。

植物原生质体的融合又称体细胞杂交技术。它是以原生质体分离、培养技术为基础，借助动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术，通过细胞融合技术可以克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍。诱导融合的方法有物理法、化学法。物理法常用电场、显微操作、离心、振动等机械力促使原生质体融合。化学法是用不同的试剂为诱导剂诱导融合。目前常用和较为有效的化学方法是PEG（聚乙二醇）与高PH-高Ca结合法。本实验采用PEG（聚乙二醇）与高PH-高Ca结合法来处理两亲本原生质体的混合悬浮液，诱导原生质体聚集，继之发生融合，最后合并成双核或多核细胞。

可用于测定原生质体活力的方法：

方法一：染色法。可用荧光素双醋酸盐(fluorescein diacetate，FDA)、酚藏花红、伊文思

蓝等染料对原生质体染色后，显微镜检查原生质体的活力。FDA染色后，在荧光显微镜下检查，活的原生质体发出黄绿色的荧光。0.01％酚藏花红染色后，光学显微镜检查，活的

10

原生质体染成红色。用0.25％伊文思蓝染色，染成蓝色的原生质体为无活力。

方法二：胞质环流法。在显微镜下观察，凡具有胞质环流者，为代谢旺盛的原生质体。原生

质体的产量和活力与所用酶的质量和处理时间有关，每克材料大约加10ml酶液。原生质

45

体培养的密度是影响培养成功与否的重要因素，起始密度一般为10～10个/ml。 三、实验仪器、材料和试剂

1、仪器、用具：离心机、天平、剪刀、水浴锅、带盖离心管（10ml）、300目镍丝网（或尼龙

网）、解剖刀、镊子、滴管、吸管、显微镜、盖玻片、培养皿、烧杯等。

2、材料：烟草叶片(如果不需要培养杂合细胞，可以选用其他浓绿色的蔬菜叶片)、胡萝卜、

西红柿。

3、试剂（选择粉末状酶制剂，并保存在-20℃；用之前再配制溶液，并且4℃保存。）

纤维素酶、果胶酶、甘露醇、甘氨酸、CaCl2·2H20、葡萄糖硫酸钾、KH2P04、PEG（6000） （一）酶液制备 （1）洗涤液：甘露醇0．6mol／L，CaCl2·2H2O 3．5mmol／L，KH2P04 0.7 mol／L，(pH5.6)， （2）混合酶液：2％纤维素酶、1％果胶酶溶于洗涤液中(pH5.6)，需过滤除菌。 （二）诱导液制备

（1）PEG溶液: 100ml水中含PEG 50g，CaCl2·2H20 150mg，KH2P04 10mg，可加热帮助溶化。 （2）高PH-高Ca溶液

A液：100 ml水中含有葡萄糖5.4g，甘氨酸0.75g ，用NaOH调PH至10.5，置4℃黑

暗处保存。

B液：100ml 水中含有葡萄糖5.4g， CaCl2·2H2O 1.47g。 A液、B液临用时等量混合

（三）等渗溶液（0.35mol/L NaCl或0.4mol/L蔗糖溶液）或原生质体培养基。 四、方法与步骤

（一）原生质体分离制备

1、称取0.5g生长良好，60～100d苗龄的烟草（蚕豆）植株中上部的叶片，用自来水洗净。吸干表面水滴，用镊子小心撕去叶片下表皮（如为胡萝卜，用解剖刀切去表皮和中柱，取用皮层部；西红柿直接取果肉），将叶片切成小片（或胡萝卜切成薄片）浸入盛有5ml 混合酶液的小三角瓶中，盖后置28～30℃保温2～3小时，其间轻轻摇荡几次。

2、取少量悬液于载玻片上，在显微镜下检查原生质体分离情况。去壁完全而活性正常的原生质体应呈球形，边缘光滑，质体内部较透明，在高倍镜下可观察到原生质体环流运动。 3、将酶解后的原生质体悬液，用300目镍丝网（或尼龙网）过滤到10ml 离心管中，以除去未酶解完全的组织。

4、将滤液用600r/min的速度离心5min，使原生质体沉淀，用吸管除去上层酶液。

5、加入约5ml洗涤液，小心将原生质体悬浮起来，待悬液充分混匀后，再一次离心。这样反复操作洗涤2～3次，洗净酶液与残余的细胞碎片。

5

6、加入约5ml 0.8mol/L甘露醇溶液，用吸管将原生质体轻轻冲起制成密度约10个/ml的原生质体悬浮液备用，（必要时取少量用血球 计数板计数后统计密度，计算血球计数板上四角的四大格内的细胞总数，按下列公式即可算出每毫升悬浮液中的细胞数。 细胞数／ml =（四大格的细胞总数/4 ）×10 000×稀释倍数） 7、用胞质环流的方法测定原生质体的活力。

11

（二）原生质体的融合

1. 离心融合法(注意滴管口产生的剪切力对原生质体的损伤，操作要慢而均匀。)

(1)将两种来源的原生质体悬液各2.5ml，在离心管中等量混合。500r/min 离心5分钟，使原生质体沉淀，吸去上清液。 (2)加入约3倍量的PEG溶液，用吸管将原生质体重新悬浮混匀，在25～30℃水浴锅中保温20～

30分钟。

(3)用细吸管吸取0.5ml高PH-高Ca2+溶液，缓慢从一边或四周滴入原生质体与PEG的混合液

中，约10分钟滴完。然后再吸取0.5ml高PH-高Ca2+溶液，约10分钟滴完(滴加速度过

2+

快可能会导致局部的高PH-高Ca，使细胞损伤。)

(4)将离心管500r/min 离心3分钟，使原生质体沉降浓缩，再将离心管置37℃水浴中保温。 (5)每隔10min取样，置载玻片上，加盖盖玻片后在显微镜下观察聚集和融合情况，记录每次

观察到的聚集程度和融合率。

(6)保温约40分钟后，取出离心管，加洗涤剂5ml，静置30分钟。

(7)如需培养，用相应的培养基洗两次后，即可接入培养基中，送入培养室。 2．玻片融合法

(1)取一带凹槽的玻片(普通载玻片也可以)，洗净，烘干、（灭菌）。 (2)将两种来源的原生质体悬液等量混合在一个干净的小离心管中。

(3)用干净吸管取2～3滴混合后的原生质体，放于载玻片上，静置15min，使原生质体贴在玻

片上。

(4)用另一支吸管将2～3倍体积的PEG溶液缓慢滴加在原生质体上，27℃～30℃温育20min。

2+

(5)用另一支吸管吸取0.5ml高PH-高Ca 溶液，缓慢加到原生质体上，静置5～10min。（可以覆盖盖玻片，以方便清洗步骤） (6)将玻片稍微倾斜，小心用吸水纸吸去上清，再将少量等渗溶液或培养基滴到原生质体周围，小心用吸水纸将液体吸去，重复1～2次，以洗涤原生质体。 (7)镜检观察。 注意事项：

1. 为便于观察和识别融合体，常选择两种带有不同色素和形态结构的原生质体作为亲本，如用绿色的叶肉细胞和黄色的胡萝卜肉质根细胞等

2. 原生质体的质量会影响融合的效果，最关键的是脱壁完全，否则不能做融合亲本。 3. 有的原生质体会很快长出细胞壁，因此洗去酶液后应立即进行融合。

4. 如融合原生质体不做继续培养，实验步骤至3就就可结束。如需长期培养，实验操作应在无菌条件下进行。 五、作业

1. 根据实验结果写一份实验报告，要求用流程图说明实验过程及注意事项。绘图表示原生质体聚集和融合的图像。

2. 如作长期培养，整个实验应作如何修改？有那些注意事项。

实验5 DNA的细胞化学――Feulgen反应

一、实验目的

了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。

12