SOD,CAT及POD活性的测定

测定方法

一．SOD，CAT及POD活性的测定

分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。

SOD活性测定

1.显色反应 取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。 混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。

当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。

表 47-1 各溶液显色反应用量 试剂酶） 0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/LMet溶液 750μmol/LNBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶液 蒸馏水 总体积 3.SOD活性测定

用量(mL) 终浓度(比色时) 1.5 0.3 13mmol/L 0.3 75μmol/L 0.3 10μmol/L 0.3 2.0μmol/L 2支对照管以缓冲液代替酶0.1 液 0.5 3.3 至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在560nm下测定各管的OD值，计算SOD活性。

3.<结果计算>

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD

活性。 SOD总活性[u/g(FW)]=

式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK ——照光对照管的吸光度。 AE ——样品管的吸光度。 VT ——样品液总体积，mL。 V1 ——测定时样品用量，mL。 W——样品鲜重，g。 蛋白质含量单位为mg/g。

愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性

1.取两支试管，洗涤后甩干水分。

试剂 0.05mol/L PH 5.5的磷酸缓冲液 2%双氧水溶液 0.05mol/L愈创木酚溶液 蒸馏水 总体积 管号（对照） 2.9ml 0 ml 1.0 ml 3.0 ml 7.0 ml 测定管 2.9 ml 1.0 ml 1.0 ml 2.0 ml 7.0 ml 将上述各管立即放入预先调好37 ℃的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。（也可以每分钟读取一次，3分钟内吸光度变化值ΔA ）

2.结果计算

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

按下式计算酶的相对活性

△A470 × 酶提取液总量（ml）

－1－1

酶活性（△A470·gFw·min）= ——————————————————— 样品鲜重（g）× 测定时酶液用量（ml）

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；

【试剂】

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 【方法】

1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。

表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管 号 粗酶液(ml) pH7.8磷酸(ml) 蒸馏水(ml) S1 0.2 1.5 1.0 S2 0.2 1.5 1.0 S3 0.2 1.5 1.0 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算：

以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

?A240?VT 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=0.1?V1?t?FW

(AS1?AS2)2式中 ?A240 = AS0－

AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； Vt—粗酶提取液总体积（ml）； V1—测定用粗酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）；

0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

【注意事项】 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。